双组分系统是微生物的主要调控系统之一，广泛存在于细菌中，一般由组氨酸激酶和反应调控蛋白组成。细菌通过组氨酸激酶感知外界信号并调控相应的信号转导，再由反应调控蛋白对感受到的信号做出细胞反应，由此应对外界刺激和环境变化。本实验以沙雷氏菌的总DNA为模板，通过PCR扩增，得到组氨酸激酶（10875）的全长及其膜外部分的基因，分别克隆至pET24b和pET28a-MBP-His载体中。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，酶切检测后鉴定出含有正确重组质粒的菌体，再转化至大肠杆菌C43（DE3）菌株中进行蛋白的异源诱导表达。经SDS-PAGE检测结果显示，含10875全长重组质粒的菌株经诱导后表达出约49kDa的蛋白，含10875胞外部分的重组质粒的菌株经诱导后表达出约53kDa的蛋白。通过Ni-NTA亲和层析对表达的蛋白进行纯化，获得了较纯的重组蛋白。本次实验为进一步探究组氨酸激酶在沙雷氏菌中的功能奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1宿主菌及质粒3
1.1.2培养基及溶液配方3
1.1.3主要实验技术3
1.1.4主要酶及试剂3
1.1.5主要仪器4
1.2实验方法4
1.2.1目的基因表达质粒的构建4
1.2.2目的蛋白的表达检测7
1.2.3蛋白的纯化7
2结果与分析8
2.1表达质粒的构建8
2.1.1PCR扩增结果8
2.1.2质粒检测结果8
2.1.3酶切检测结果8
2.2大肠杆菌C43（DE3）重组质粒的表达结果9
2.3蛋白纯化结果10
3讨论11
3.1组氨酸激酶的作用11
3.2重组蛋白的构建与表达11
3.3研究价值与展望11
致谢12
参考文献12
附录13
沙雷氏菌FS14中组氨酸激酶10875全长及其膜外部 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
分的表达纯化
引言
引言
在自然界中，除了动物和植物，还分布着许多体积微小、种类繁多的生物，称为微生物，包括细菌、真菌、放线菌和病毒等。微生物对外界环境的适应能力很强，可以在更加复杂和特殊的环境中生长[1]，它对环境的适应性主要是通过其复杂的信号转导途径来实现的。双组分系统是微生物的主要调控系统之一[2]，广泛存在于细菌中，一般由组氨酸激酶和反应调控蛋白组成。细菌通过组氨酸激酶感知外界信号并调控相应的信号转导，再由反应调控蛋白对感受到的信号做出细胞反应，由此应对外界刺激和环境变化。双组份系统在细菌的各个调控系统中具有至关重要的地位[3]。
本课题中的组氨酸激酶（10875）属于Cpx双组份系统中的组氨酸激酶CpxA。Cpx双组份调控系统是一类常见的双组分系统，存在于大部分革兰氏阴性菌中[4]。pH、盐离子浓度、蛋白的错误折叠等细胞周围环境的变化都有可能激活Cpx系统[5]，它的主要功能是感受细胞膜压力变化，有选择的激活下游基因转录，从而应对这些外界因素，用更为细致的方式实现对细菌生命活动的调节。CpxA在细胞内膜上镶嵌分布，通过HAMP连接区将位于细胞周质的信号输入区和位于细胞质的自身激酶区相连。N端信号输入区可以感知外界环境的变化，C端自身激酶区由His磷酸化位点和催化区组成，它作为激酶核心，同时具备激酶和磷酸酶的活性[6]。细菌感受外界环境信号时离不开CpxA的支持，它在Cpx双组份系统中占据着重要地位[7]。
Cpx双组份系统会对细菌的生存和致病性产生影响。细菌的致病过程主要是通过其与宿主细胞之间的一系列相互作用造成的，细菌通过毒力因子在细胞膜的聚集和释放，造成宿主细胞的中毒死亡[8]。因此，细菌的致病性与细胞膜结构和功能的完整性密切相关。相关研究表明， Cpx系统在发挥其调控作用的同时，可以对细菌的毒力产生影响，从而影响细菌的致病性[9]。因此，Cpx系统在细菌的生长繁殖和环境适应方面起到重要作用。
Cpx系统对多种病原菌的毒力具有调控作用[9.10]，其调控功能主要通过两个方面影响细菌的感染过程：一是影响细菌分泌系统，如假结核耶尔森菌中的YscYop三型分泌系统，Cpx系统通过影响YscYop的效应蛋白YopS 向宿主真核细胞的转位，调节透明质酸酶及其调控因子 RovA 等的表达，间接影响细菌对宿主细胞的粘附和入侵，以及对淋巴细胞的吞噬能力做出反抗[11]；二是影响毒力因子的表达，如影响细菌菌毛的表达，包括尿道致病性大肠杆菌P菌毛的合成、肠道致病性大肠杆菌四型维管束形菌毛的装配等[12]。也有研究表明，Cpx系统也可以通过影响DsbA 等周质蛋白的表达来增强细菌的毒力作用。归根结底，我们可以认为，Cpx系统是因为膜表面被破坏而被激活的，它进行的任何毒力调控都是其为恢复细胞膜的完整而进行的一系列反应[11]。
双组份系统能够增强细菌对外界环境的适应性，尤其是介导致病菌产生抗生素耐受性。在大肠杆菌中，CpxR超量表达能提高细菌对多种药物的耐受性，包括脱氧胆酸盐、新生霉素、卡那霉素和丁胺卡那霉素等，进一步研究表明，Cpx系统可以通过调控药物外排系统基因acrD的表达来影响细菌的抗药性[5]。Cpx系统不仅可以调控大肠杆菌、沙门菌等对β－内酰胺类药物的耐药性，同时对多种细菌的多重耐药性亦有重要调控作用。
沙雷氏菌是革兰氏阴性菌的一种，又称灵杆菌，通常存在于动植物、水、土壤和人体中。本实验将粘质沙雷氏菌FS14中组氨酸激酶（10875）的全长及其膜外感受结构域部分的编码基因用PCR技术扩增，克隆至表达载体中，转化到目标受体菌并诱导其表达，对表达所得到的蛋白进行纯化。希望能通过本次实验为进一步探究组氨酸激酶在沙雷氏菌中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1宿主菌及质粒
Serratia marcescens FS14（本实验室分离，鉴定和保存）、大肠杆菌DH5α（本实验室保存）、大肠杆菌 C43(DE3)（本实验室保存）、pET24b（本实验室保存）、pET28aMBPHis（本实验室构建）

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606540.html