细菌体内的双组分信号转导系统主要由组氨酸激酶和反应调控蛋白组成，通过双组分蛋白的磷酸化反应以调节细胞内信号的传导途径。本课题以沙雷氏菌FS14的总DNA为模板，利用聚合酶链式反应扩增组氨酸激酶03615全长及其膜外部分基因，分别克隆到pET24b和pET28a-MBP-His载体，并将其转化到大肠杆菌C43（DE3）中进行诱导表达。两种蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了重组蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示，含03615全长部分的重组质粒的菌株经诱导后表达出约66kDa的蛋白，含03615膜外部分表达出约56kDa的蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1质粒及菌种3
1.1.2培养基及溶液配方3
1.1.3酶及试剂3
1.1.4主要实验仪器3
1.2方法 4
1.2.1设计引物4
1.2.2聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因4
1.2.3 PCR产物的回收5
1.2.4目的片段与表达载体的限制性酶切及其连接5
1.2.5将连接产物转化进大肠杆菌DH5α6
1.2.6碱裂解法抽提重组质粒7
1.2.7重组质粒的酶切鉴定7
1.2.8 目的片段的序列测定8
1.2.9将重组质粒转化进大肠杆菌C43（DE3）8
1.2.10重组蛋白的诱导表达8
1.2.11表达检测8
1.2.12收集菌体9
1.2.13菌体破碎9
1.2.14 NiNTA亲和层析9
2 结果与分析10
2.1 03615全长及其胞外片段重组表达质粒的构建10
2.1.1引物扩增结果10
2.1.2 PCR产物的回收及回收检测结果10
2.1.3提取质粒结果11
2.1.4 酶切结果11
2.1.5重组质粒鉴定结果13
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.6重组质粒的酶切鉴定结果13
2.1.7测序结果14
2.2诱导表达检测结果15
2.3蛋白NiNTA亲和层析纯化结果16
3讨论17
3.1 重组质粒的构建与表达17
3.2 双组分系统EepSR的作用机制17
3.3 组氨酸激酶的研究进展17
致谢19
参考文献20
沙雷氏菌FS14中组氨酸激酶03615全长及其膜外部分的表达纯化
引言
引言
细菌在自然界中的分布十分广泛，对于人类而言有利有弊，细菌在其进化过程中已经演变出可以通过体内的多种转导途径来感应外界环境中的各种信号的传递方式，以调控体内相关基因的表达，从而帮助细菌适应环境变化来保证其正常生长和繁殖。其中，双组分系统（twocomponent systems，TCS）作为细菌体内最重要的调控系统[1]，广泛存在于原核生物细胞中，典型的TCS通常由负责信号感知的组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和负责基因调控的反应调节蛋白（response regulator，RR）构成[2]，大多数细菌通过双组分系统的蛋白的磷酸化和去磷酸化调节细胞信号传导途径以应对多种环境变化、代谢和细胞周期信号[3]。研究表明，几乎所有的细菌中都存在双组分系统，目前已经发现总共有200300对不同的HKRR[4]，在大肠杆菌中含有16对HKRR，它们各有分工且互相合作，共同维持细胞的稳定生存。除了细菌外，在原生动物、真菌和植物等一些真核生物中也发现了双组分系统的存在[5]。本课题主要对细菌中EepS和EepR组成的双组分调控系统进行研究，双组分EepSR系统可以通过转录调控swrW和pigApigN操纵子来调控粘质沙雷氏菌的色素沉着、溶血作用和群集运动[6]。对于细菌双组分系统的不断深入研究，可以对其组氨酸激酶和反应调节蛋白的结构功能，以及二者相互应答的作用机制取得进一步的认识。
粘质沙雷氏菌是一种来源于土壤和水中的细菌，在医学水平上它也是一种重要的条件致病菌，可以引起人体眼部感染[710]。近年来，在重症监护病房所收集到的菌体已经对抗生素产生了较强的耐药性[11]。同时，粘质沙雷氏菌也是隐形眼镜的主要污染物，它可以使人感染上具有威胁视力的角膜炎及其他眼部疾病[1214]。同时，反应调节蛋白EepR调控产生的次级代谢产物灵菌红素和Serratamolide在医学上具有治疗潜力，灵菌红素具有抗癌、抗疟疾、抗微生物、免疫抑制[15]的作用。在抗癌方面，灵菌红素对于癌组织具有高针对性，对正常细胞则表现出低毒害作用；灵菌红素还可以促进细胞集结，以阻止癌细胞对周遭组织的入侵，抑制癌细胞浸润转移[16] ，从而成为一种非常有潜力的抗癌物质。此外，由于临床上长期存在抗生素滥用的现象，越来越多细菌出现了耐药性问题，可以针对该蛋白酶在分子水平上定向改造发现新的抗菌药物靶点提供新的思路。因此，了解它们的分子作用机制对基础科学研究和医学应用治疗都具有重要意义。
综合来看，针对双组分系统EepSR的研究不仅可以为蛋白质分子的晶体学研究奠定生物学基础，还能为该蛋白酶在分子水平上的从而加大其在工业、食品和医药等各大领域内应用的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1质粒及菌种
表达载体：pET24b、pET28aMBPHis，由本实验室保存；
克隆宿主菌：大肠杆菌菌株DH5α，由本实验室保存；
表达宿主菌：大肠杆菌菌株C43（DE3），由本实验室保存。
1.1.2 培养基及溶液配方
液体LB培养基：10g胰蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母提取物，去离子水定容至1L；
固体LB培养基：在液体LB培养基中加入终浓度1.5%的琼脂粉‘；
PMSF溶液：母液0.2 M 0.348g、10 mL异丙醇、45 ℃水浴溶解；

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