目录
摘要1
关键词............1
Abstract2
Key words2
引言3
1试验材料和试剂3
1.1 试验所需菌株及质粒 4
1.2 试验试剂及试剂盒 4
1.3试验仪器5
1.4培养基及配制溶液6
2组氨酸激酶11410全长以及其膜外部分的原核表达构建6
2.1目的基因表达质粒的构建6
2.1.1引物设计和PCR扩增7
2.1.2片段与载体的酶切连接8
2.1.3转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞 9
2.1.4酶切验证和测序比对10
2.1.5转化至大肠杆菌DE3感受态细胞10
2.2试验结果11
2.2.1 PCR扩增结果11
2.2.2质粒构建结果11
2.2.3测序比对结果12
3组氨酸激酶11410全长以及其膜外部分的纯化12
3.1目的蛋白的表达检测12
3.2蛋白的纯化13
3.2.1粗蛋白的提取13
3.2.2 NiNTA亲和层析13
3.3实验结果13
3.3.1 DE3重组质粒的诱导表达结果13
3.3.2蛋白纯化结果15
4讨论16
4.1组氨酸激酶的作用机制以及国内外研究现状16
4.2重组质粒的构建与表达16
4.3展望17
致谢17
参考文献18
沙雷式菌FS14中组氨酸激酶11410全长
以及其膜外部分的表达纯化
摘 要
细菌双组分系统（twocomponent system，TCS）是原核细胞中存在的主要信号转导系统，主要由组氨酸蛋白激酶 (histidine kinase, HK )和反应调控蛋白(response regμLator, RR)两个组分组成。其中组氨酸蛋白激酶感应外界和细胞内部的环境刺激。组氨酸蛋白激酶又名感应蛋白，它是一个参与信号传导的重 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
要衔接蛋白。通常组氨酸蛋白激酶是一个跨膜蛋白，它是由两个单体组成的同源二聚体膜蛋白，同源二聚体膜蛋白中每个单体必定含有一个可变传感器结构域(sensor domain)和一个保守传递器结构域 (transmitter domain)，它们通过一个跨膜螺旋相连。组氨酸激酶的传感器结构域在感受感应内环境变化的同时，也传递信号到细胞质传递器的催化结构。本实验以沙雷氏菌的总DNA为模板，通过 PCR方法，扩增得到组氨酸激酶11410及其胞外结构域的编码基因。然后，将目的基因连接到表达载体，构建含有目的基因的表达质粒，然后将判定正确的质粒转入大肠杆菌中，再进行表达。本次实验主要在于表达纯化沙雷氏菌中的组氨酸激酶以便进行后续结构研究。
引言
由于细菌所生活的环境中充满了动态和未知的变化，因此细菌需要建立一种更加精准且迅速地响应外界刺激信号并且做出反应的信号转导机制，以便于自身在复杂多变的环境下生存[1]。为应对不同的生存环境，细菌因此演化出多种细胞信号转导途径用以应对，其中双组分系统在原核生物体中被广泛应用于信号转导，其过程由不同的蛋白酶催化完成。众所周知，几乎所有细胞都会利用磷酸化介导的信号转导机制来应对代谢，以及环境和细胞周期等变化。总之，组氨酸激酶及其效应蛋白组成的双组分信号系统 (twocomponent systems)是原核生物中一种主要的跨膜信号转导系统。
双组分系统一般由两个蛋白构成：一是组氨酸蛋白激酶（histidine kinase，HK），又名感应蛋白，通常它是一个跨膜蛋白，结构可分为三部分，自N端到C端依次为：第一，配体(信号)结合部位，该结构域为高度可变区；第二，组氨酸自身磷酸化位点，其分子构象为二聚体；第三，ATP结合的激酶功能区，其中含有N、Gl、F、G2四个保守的基序(motif)。另一个蛋白为反应调控蛋白（RR），它是一个存在于细胞质中的蛋白。RR结构上分为两部分，N端的调控区域，含有能接受磷酸基团的天冬氨酸位点，N端相对保守； C端为效应区，序列高度可变，含有多个可与不同的DNA序列特异结合的位点[2]。
双组分系统的作用机制是当外界信号作用于感应蛋白激酶的膜外配体结合区时，激活激酶的ATP结合部位结合、将ATP水解为ADP，消耗能量并将ATP的磷酸基团转移到激酶上的组氨酸位点，使HK自身发生磷酸化。随后，反应调节蛋白的调控区域能与磷酸化的组氨酸蛋白激酶相互作用，将激酶上的磷酸基团转移到自身的天冬氨酸位点上，发生自身磷酸化，并能激活效应区，使其构象改变，暴露不同的DNA结合位点，结合不同的DNA序列，从而进行了一系列基因的表达调控[3]。
双组分信号转导系统的发现，加深了人们对微生物体内复杂调控网络的理解。由于其广泛地参与了微生物的各项生命活动，尤其是在致病性和抗生素抗性等方面，这致使我们能够通过抑制、中和或突变的方法干扰一种或多种毒力因子的功能，通常对感染的生物体造成有利的结果。
1 试验材料和试剂
1.1试验所需菌株及质粒
Serratia marcescens FS14（本实验室分离，鉴定和保存）、大肠杆菌DH5α（本实验室保存）、大肠杆菌E.coli DE3（本实验室保存）、pColdⅡHis（本实验室保存）、pColdⅡHis（本实验室构建），其中载体质粒pColdⅡHis的物理图谱见图：

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606537.html