目录
摘要 Ⅰ
关键词 Ⅰ
ABSTRACT Ⅱ
KEYWORDS Ⅱ
引言 1
1 文献综述 1
1.1 RdDM途径的基本过程 1
1.2 RdDM途径的调控 2
1.3 DNA甲基化的维持 3
1.4 非经典RdDM途径 3
1.5 甲基化修饰的移除 4
1.6 DNA甲基化的生理功能 5
1.7 DNA甲基化的主要检测方法 5
1.7.1 测序类手段 5
1.7.2 酶切类手段 6
1.7.3 免疫共沉淀类手段 6
1.8 展望 6
2 方案论证 7
2.1 本课题的目的、意义和设计原理 7
2.2 方案选择 7
2.3 技术路线 8
3 材料与方法 8
3.1 基因共表达分析 8
3.2 韦恩图绘制与待检基因二轮筛选 8
3.3 差异表达基因分析 9
3.4 互作组分析 9
3.5 突变体选择 9
3.6 基因分型引物设计 9
4 结果与分析 10
4.1 与RdDM途径已知调控因子的编码基因共表达的基因的筛选 10
4.2 TYLCV侵染植株中差异表达的基因的筛选 11
4.3 候选基因表达产物的相互作用网络 14
4.4 突变体选择与基因分型引物设计 15
5 讨论和结论 17
参考文献 19
附录 23
致谢 27
拟南芥RdDM途径辅助调控因子的筛选与鉴定
摘 要
植物中，DNA甲基化主要通过RNA介导的DNA甲基化(RdDM)途径建立。RdDM对植物的正常生长发育至关重要，在调控基因表达、稳固基因组和响应胁迫等生理过程中都发挥着关键作用。当前，已有大量可能编码RdDM调控因子的基因被成功鉴定，但此途径的具体过程仍有待进一步研究和细化。本研究通过基因共表达筛选和韦恩图交集分析得到了 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
37个编码可能参与调控RdDM因子的基因，并分别对这些基因进行了转录组与互作组分析，筛选感染番茄黄化曲叶病毒(TYLCV) 的烟草植株中差异表达基因的拟南芥直系同源基因，并绘制出候选基因表达产物与其他拟南芥蛋白间的互作关系网络。结果表明，TYLCV在侵染过程中可能会通过操纵部分候选基因的表达以协助自身增殖，并揭示出含富亮氨酸重复序列(LRR)的免疫受体蛋白活化的Ca2+信号转导通路与RdDM间的潜在联系。综上，本研究阐明了候选基因表达产物可能的生物学功能，为进一步认识复杂的RdDM途径调控机制开辟了道路。
引言
胞嘧啶残基上的DNA甲基化是一种保守的表观遗传修饰，在植物的生长发育中发挥着关键作用。植物中DNA甲基化的从头建立主要通过RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation pathway, RdDM)途径实现。
当前，人们对于RdDM途径的认识已较为深入。经典RdDM途径主要包括小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)产生、沉默复合体组装和甲基化标记形成等过程[1]。通过RdDM通路建立起的甲基化修饰需要和组蛋白的修饰相互协同，重塑染色质的结构，使DNA甲基化区域的表达活性降低，最终建立起异染色质状态[2]。DNA复制过程中，母链上的甲基化标记需要在多种酶的参与下传递给子代，同时，甲基化的建立需要与去甲基化相互平衡，使细胞内各基因的表达受到严格的调控[3]。
当前，已有大量参与调控RdDM的因子被鉴定出来，且围绕这些因子的功能性研究层出不穷，但这些因子间的相互作用关系及部分关键蛋白的招募机制还有较多的空白未被填补。此外，越来越多的证据表明植物DNA甲基化的建立还可以在转录后水平基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS)途径和RdDM的协作下共同完成，即非经典RdDM途径，但这些途径的具体过程还不够明朗，仍有待进一步细化。
双生病毒科的番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV)所引起的病害会导致番茄的产量显著下降，使植株表现出矮小、萎蔫等症状，严重危害番茄农业[4]。当受到病毒感染时，植物会激活自身的免疫系统，通过RdDM途径在侵入细胞的病毒基因组DNA上添加甲基化修饰，从而抑制病毒增殖及毒力基因表达。而与此同时，病毒为实现成功的侵染，会通过与植物RdDM中的组分相互作用以干扰甲基化的建立，从而促进病毒增殖[5]，病毒和植物体之间形成此消彼长的防御和反防御关系。
本课题运用正向遗传学方法，从基因表达数据库里筛选出拟南芥(Arabidopsis thaliana)中与已鉴定的RdDM途径调控因子的编码基因共表达的基因，利用互作组数据库构建出这些基因的表达产物与其他拟南芥蛋白间的互作关系网络，并筛选出受TYLCV侵染时表达量发生显著变化的基因。此外，还选择并订购了用于后续基因功能研究的拟南芥TDNA插入突变体，并针对每一种突变体设计了相应的基因分型引物。

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