目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1 灵芝野生菌株培养 3
1.2灵芝野生菌丝RNA提取 3
1.3灵芝sRNA的克隆与测序3
1.4序列分析3
2结果与分析5
2.1 RNA质量检测5
2.2 HiSeq测序sRNA文库的特征 5
2.3 sRNA在基因组上的表达及分布分析 6
2.4 已知miRNA比对 8
2.5 重复序列的去除 8
2.6 rRNA，scRNA，snoRNA，snRNA，tRNA等相关的序列的去除 9
2.7 sRNA中外显子和内含子的去除 9
2.8 sRNA分类注释 10
2.9 新miRNA预测 11
3讨论 12
致谢12
参考文献13
基于高通量测序的灵芝microRNA筛选及生物信息学分析
摘 要
灵芝是一种大型担子菌，在中国乃至东南亚地区种植十分广泛。其含有的多种生物活性物质，如灵芝多糖、灵芝三萜，具有抗癌、抗炎症、降血压等功效。随着灵芝基因组测序的完成，通过生物信息学方法从分子层面研究灵芝microRNA（miRNA）对活性物质的调控已成为可能。有研究表明miRNA可以通过阻止翻译和降解messenger RNA(mRNA)的方式调控靶基因表达，从而对生物体表型产生影响。本研究基于HiSeq测序，从灵芝菌丝中提取总RNA，对small RNA（sRNA）中各组分进行生物信息学分析，与数据库比对，筛选出潜在的新miRNA，并对预测结果进行准确性评估。使用软件与数据库比对发现，在灵芝菌丝样品中有1929个已知miRNA。rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA的种数分别为21721，2617，2513和420。sRNA中外显子和内含子的正义链reads种数分别为399631和28901，而反义链reads种数分别为40123和14317。经过sR *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
NA分类注释后，对新miRNA进行预测，得到178个新miRNA。本课题通过生物信息学方法筛选灵芝菌丝内潜在的miRNA，为研究miRNA对灵芝三萜合成的调控提供研究基础。
引言
灵芝（Ganoderma Lucidum Karst）是真菌界（Kingdom Fungi），担子菌门（Basidiomycota）中的一种大型药用真菌，是东亚种植最广泛的食用菌之一。灵芝内包含多种生物活性物质，主要有多糖、三萜类物质。灵芝多糖能够抗癌和提高免疫力；灵芝三萜具有保肝排毒、抑制癌症、抗炎症、调节血脂、降血压等功效，在医疗领域具有重要而广泛的药用价值，其药理活性已得到广泛认可。研究表明，这些药理化合物被认为是潜在的候选药物，但由于目前这些次级代谢产物的含量较低，基础生物学研究的匮乏，阻碍了其商业价值的进一步发展。随着灵芝的基因组序列的测序完成，灵芝已渐渐成为研究大型担子菌次级代谢调控的潜在模型。近年来。通过外源环境调控以及基因工程手段提高灵芝次级代谢产物的含量成为了研究的热点问题。目前对于灵芝次级代谢的调控方式主要集中在三个方面，通过改变物理条件（如热胁迫）、添加化学试剂（如茉莉酸甲酯，水杨酸等）、改变培养基质的营养条件（如碳源，氮源等）三种方式提高灵芝次级代谢产物的含量，尤其是灵芝三萜的含量，并发现了一些功能基因参与这些条件对灵芝三萜合成的调控[1]。除了上述关注的研究角度，随着生物信息学的发展，各种组学的发展也为研究者从另一个角度研究灵芝三萜的调控机制提供了方向。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物间基因调控的一种保守机制，常包含长度为20—40个核苷酸（nucleotide，nt）的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）[2]。参与RNAi过程的小RNA（small RNA，sRNA）成分很多，其中MicroRNA（miRNA）就是一类生物生长发育过程中内源产生的非编码的，长度一般在1821nt的小RNA[3]，它在各种生物代谢活动中起着至关重要的作用。在此过程中，miRNA的初级转录本在酶切作用后产生miRNA的前体和成熟的miRNA。随后miRNA将与RNA诱导的沉默复合物结合，通过抑制翻译过程和降解mRNA达到调节靶基因表达的效果。miRNA最早在秀丽隐杆线虫中被发现[4]，之后于植物拟南芥中发现[5]，随后在其他常见作物中被大量发现。有研究显示miRNA对于提高植物抗逆性，增强作物产量和质量有重要意义，其在生物细胞代谢、生长发育、增殖、分化、凋亡等多种进程中都发挥着不可缺少的调控作用。miRNA在生物体内具有多种调控机制，包括抑制mRNA翻译、靶向mRNA的切割和染色质修饰[6]。在已知报道中，对miRNA的产生和作用机制研究在植物、动物中较为深入，而在真菌中近年来也逐渐开展了研究[7]。
目前，鉴定miRNA一般有3种方法：基因筛选、克隆和生物信息学分析。miRNA最初通过基因筛选法被发现，但这种方法有明显的缺陷，成本高、费时且结果具有偶然性。克隆miRNA并构建sRNA库也是一种有效的方法，该方法已被成功应用于鉴定植物中的miRNA，但只有当样本中miRNA量足够大时才能通过克隆或Northern blot进行检测。且miRNA的产生具有组织特异性和阶段性，在某些特殊情况下难以被该方法准确检测。为了能成功找到低表达的miRNA基因，生物信息学分析成为了一种方便有效的方法。该方法可以预测低表达，难以克隆的miRNA，具有可高通量检测，速度快的优点。由于miRNA在植物或动物中具有高度保守性，有研究中通过这种方法确定了许多miRNA[6]。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606521.html