atp合酶基因沉默对灵芝乙酰辅酶a代谢的影响研究【字数：5513】
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1 菌株和质粒4
1.1.2 实验相关引物4
1.1.3试剂与溶液4
1.1.4主要仪器设备4
1.2 方法 4
1.2.1菌株培养4
1.2.2 PCR扩增4
1.2.3 荧光定量PCR检测5
1.2.4酶连酶切体系5
1.2.5 DH5α感受态制备和转化6
1.2.6灵芝原生质体制备及脂质体转化6
1.2.7灵芝胞内ATP的检测6
1.2.8乙酰辅酶A含量测定6
1.2.9总灵芝酸测定6
1.2.10结果分析方法6
2 结果与分析7
2.1构建ATPsynbpmi质粒7
2.2检测基因表达水平8
2.3检测菌丝生长情况8
2.4检测ATP变化趋势9
2.5检测灵芝酸变化趋势10
2.6检测乙酰辅酶A变化趋势10
3 讨论 11
致谢 12
参考文献12
ATP合酶基因沉默对灵芝乙酰辅酶A代谢的影响研究
引言
灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.]又称瑞草，是自然界分布的 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: *351916072*
一类真菌生物，是著名的药、食真菌，其分布十分广泛，遍布世界各个地区。在中国，2000多年前就已经有灵芝入药使用的记录，同时其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药[1]。按照赵继鼎于2000年版中国真菌志中的记载，中国灵芝科真菌共有4 属98种[2]。灵芝所含的化学成分十分复杂，有灵芝多糖、灵芝酸、生物碱等多种成分。
灵芝酸作为灵芝药理活性化合物中重要的化学成分，是灵芝的次级代谢产物，其生物合成过程受到众多因素的调控，因此针对灵芝酸的生物合成的研究具有重要的意义。前人的研究证明了环境改变对灵芝酸的生物合成有影响，Zhang等人提出了三阶段光照发酵法，他们发现光照强度与波长对灵芝酸合成具有影响[3]。Liu等人研究发现热胁迫会通过影响膜流动性影响次级代谢产物灵芝酸的生物合成[4]。
灵芝酸是乙酰辅酶A首先合成甲羟戊酸[5,6]，然后通过甲羟戊酸途径合成的[7,8]。乙酰辅酶A是辅酶A的乙酰化形式。而乙酰辅酶A作为灵芝酸合成的前体物质，对研究灵芝酸的合成代谢具有重要的价值。
另外，乙酰辅酶A不仅是灵芝酸合成的前体物质，同样是糖、蛋白等营养物质合成代谢的重要中间产物，营养物质通过乙酰辅酶A通路释放能量用以ATP的合成[9]。根据已有研究证明，ATP含量的变化可以影响细胞次级代谢，Wang等人发现菌体胞内ATP含量对丝状真菌胞外纤维素酶的合成具有影响作用[10]。故而，ATP含量对于灵芝酸的合成代谢具有重要的研究意义。
ATP产生的主要途径是以ATP合酶作为最后一个线粒体复合物的氧化磷酸化途径。ATP合酶是一种具有复杂结构的大分子蛋白质复合物（约500kDa），ATP合酶主要由两个转动马达组成:F1和F0[11]。利用线粒体内膜两侧质子梯度差，该酶可以合成ATP也可以逆水解ATP。其中ATP合酶b亚基位于F0疏水蛋白复合体，是ATP合酶的支架蛋白，研究显示在果蝇细胞中可以通过不同的培养条件可以通过ATP合酶b亚基改变果蝇体内ATP状态来调控果蝇寿命[12]。
本研究通过对灵芝中ATP合酶b亚基进行沉默，进一步观察测量沉默株的表型与野生型之间的差异来研究ATP合酶b亚基对灵芝生长及代谢的影响。将乙酰辅酶A作为沟通灵芝ATP与灵芝GAs代谢之间的桥梁，来研究灵芝ATP在灵芝次级代谢中的作用。
1 材料与方法
材料
1．1．1 菌株和质粒
灵芝（G. lucidum）菌株G20由上海农科院提供。溶壁酶购自广东省微生物研究所、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司。
1．1．2 实验相关引物
表1 本文所用引物
Table1 Primer sequences used in the paper
Abbreviation
Sequence 5’3’
Description
YSNATP5BIF
GTACggtaccCTTCATCCTCATTTCGTTCA
Forward
YSNATP5BIR
GTACactagtTTGCGTCTTGTCGTTGCT
Reverse
RTF
CCCAACCTTGTCACGAA
Forward
RTR
AACGAAATGAGGATGAAGAA
Reverse
1．1．3 试剂与溶液
试剂：PCR相关试剂、冰醋酸、95%乙醇、高氯酸等。
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606503.html
