衣康酸及其关键合成酶顺乌头酸脱羧酶在金针菇能量代谢以及氨基酸代谢中的调控作用【字数：12214】
fungi.It has been reported that ltaconic acid in basidiomycetous fungus is produced by trans-aconitine decarboxylase and isomerase whitch encoded by TAD1 and ADI1 genes. Therefore, in this study, the contents of lysine and arginine were measured by inducing the growth of liquid mycelia of F. velutipes with different concentrations of itaconic acid to preliminarily explore the function of itaconic acid in F. velutipes and the effect of itaconic acid on amino acid metabolism of F. velutipes. ADI1 and TAD1 genes of F. velutipes were cloned then conducted bioinformatics analysis and verification. Adi1 and Tad1 silencing strains of F. velutipes were constructed. ADI1 gene of F. velutipes is closely related to foraminifera , the total length of ADI1 gene were 1431 bp and the TAD1 gene is closely related to armillaria mellea , the total length of TAD1 were 930 bp.Liquid mycelia fermentation experiments showed that the contents of arginine and water-soluble protein in wild-type F. velutipes mycelia induced by ltaconic acid at a concentration of 0.5 mM were significantly increased, while the contents of lysine were not significantly changed. Finally, we proved that F. velutipes indeed use the pathway of synthesis itaconic acid whicth different from Aspergillus terreus , and the biological function of itaconic acid was preliminarily explored through the liquid fermentation experiment of F. velutipes, which provided an idea for us to study how to improve the quality of F. velutipes.KEYWORDS: Itaconic acid；F. velutipes；bioinformatics analysis；energy metabolism；amino acid metabolism金针菇(F. velutipes)，又称冬菇、朴菇、毛柄金钱菌等，属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属，是全球有名的食药两用菌，营养价值和药用价值极为丰富[1,2]。据测定，金针菇氨基酸含量比一般菇类要高，特别是赖氨酸、精氨酸含量丰富[3]。现代医学认为，赖氨酸有助于幼儿的生长发育，帮助人们提高记忆力，开发智力；精氨酸有利于胃、肠道急症等消化系统疾病的预防和治疗[4,5]。此外，金针菇还含有多种生理活性物质例如多糖、粘多糖、构菌素等，它们有助于抑制肿瘤，提高人体免疫力因而在国际市场上还享有“超级保健品”的荣誉[6]。衣康酸是工业合成产业的重要原料，它和它的衍生物可用于生产粘合剂、药品、合成树脂等共聚物[7]。衣康酸的生物合成首先在子囊菌曲霉（Aspergillus itaconicus）中被发现[8]并且相关物种土曲霉（A. terreus）至今仍被用于工业发酵生产衣康酸[9,10]。衣康酸活泼的化学性质使得它可以轻易地转化为3-甲基四氢呋喃，这是一种优质的生物燃料[11]。因此，衣康酸被认为是“最有价值的化学物质”之一[12]。近年来，衣康酸在小鼠巨噬细胞活化过程中被检测到，使得它成为生物医学研究热点[13,14]。有研究者发现衣康酸可以抑制异柠檬酸裂解酶的活性从而抑制细菌的乙醛酸循环，因此认为衣康酸是一种有益于免疫的代谢物[15]。衣康酸能抑制IFN信号来限制炎症反应，并在细胞和生物水平降低宿主对细菌和病毒的易感性[16,17,18]。此外，衣康酸似乎发挥了细胞保护作用，例如在一定条件下限制活性氧的合成[19,20]。近期有报导称衣康酸还是腹膜肿瘤的生长因子，这意味着编码衣康酸的关键合成酶的CAD基因的抑制剂可能被用作抑制腹膜肿瘤的药物[21]。许多人类致病菌已经进化出衣康酸的降解途径来作为对抗反应，种种迹象都表明了衣康酸的生物学功能和生物医学的相关性[22]。而衣康酸的关键合成酶顺乌头酸脱羧酶更是在衣康酸的生产中起到核心作用。早在1957年，微生物通过三羧酸循环中间产物顺乌头酸脱羧产生衣康酸的生物合成途径就已经被发现，然后相关基因直到近期才被确定[23]。在土曲霉（A. terreus）中，基因CADA编码顺乌头酸脱羧酶[24]。CADA基因是与衣康酸生物合成相关的基因簇的一部分，该基因簇还包括一个线粒体TCA转运体、一个膜透过酶和一个转录因子，这些基因被用来调节基因簇的特异性表达[25]。衣康酸合成的生化机制，包括其遗传背景的阐明，催生了在异源宿主中建立衣康酸的代谢工程的研究热潮[26,27]。许多改良过的工程菌株被用于工业生产衣康酸。在植物治病性担子菌玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中也观察到了衣康酸的存在[28]。随后有研究者报导了担子菌中衣康酸的另外一条合成途径。担子菌玉米黑粉菌（U. maydis）通过反式乌头酸脱羧产生衣康酸，反式乌头酸是由乌头酸异构酶（aconitate-Δ-isomerase，ADI1）产生的，属于参与细菌降解的PrpF蛋白家族。反式乌头酸的脱羧反应由反式乌头酸脱羧酶（trans-aconitate decarboxylase，TAD1）催化[7]。这一研究发现为衣康酸在其他物种中的生物学功能研究提供了新的思路。对于微生物来说，产生衣康酸对其自身是有益的[7]。一方面衣康酸可作为以乙醛酸循环为能量来源的细菌的直接抑制剂，从而提高本身的存活率，另一方面有机酸的产生和释放使得环境中PH降低，再加上其本身对低PH的耐受性使得微生物自身能够在周围环境中获得较大的竞争优势[29]。目前金针菇生产技术体系已趋于稳定，产业已由单纯的提高金针菇产量和生产规模向金针菇品质提升转型。在金针菇规模栽培过程中，通过特殊技术手段定向提高金针菇中氨基酸含量尤为重要。本文首先通过设置不同浓度衣康酸诱导野生型金针菇液态菌丝发酵，测量野生型金针菇菌丝中精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白含量，然后通过NCBI获得微生物中的ADI1和TAD1基因，比对金针菇基因组库，获取金针菇ADI1和TAD1全长基因的cDNA序列并分别对两种基因进行生物信息学分析，最后利用金针菇ADI1和TAD1基因cDNA序列设计引物构建沉默载体。因此，基于衣康酸及其关键合成酶对金针菇能量代谢以及氨基酸代谢调控的初步研究以及对于衣康酸在金针菇中的生物合成途径的验证，将有利于拓宽我们对金针菇中衣康酸生物学功能的认识，为金针菇的品质调控研究提供新思路，进而有助于将理论转化为实际应用，增强我国食用菌产业核心竞争力。文献综述衣康酸学名为甲叉丁二酸,在全球有机酸的使用量中排在前列，由于其活泼的化学性质和工业上广泛的用途，许多生物科学领域工作者对衣康酸的研究着力在如何选育和构建高效率、高产量的产酸工程菌株上，从而提高经济效益。近年来，国外研究者发现衣康酸参与了小鼠巨噬细胞抗炎代谢过程，衣康酸随之成为研究热点，随后一系列报导表明衣康酸在细胞免疫过程中扮演着重要作用，不过对于衣康酸生物学功能的研究偏向于生物医学领域，对于其生物合成途径、相关基因调控机理、信号转导等基础性研究也仅限于子囊菌土曲霉和小鼠巨噬细胞中，对于其他物种，衣康酸是否也有着相同的生物合成途径和生物学功能，我们缺乏可靠的研究资料。国内有关衣康酸的研究大都着力于如何获取高效率和高产量的同源或异源衣康酸产酸菌株，对于衣康酸的相关生物功能基础研究十分匮乏。在近期的报导中，有学者在植物致病菌玉米黑粉菌中发现了衣康酸产生，并最终提出了一条不同于土曲霉的担子菌中衣康酸生物合成途径，本文正是基于这一研究发现，在同样是担子菌的金针菇中寻找合成衣康酸的相关基因并进行生物信息学分析后构建沉默载体，同时利用不同浓度衣康酸诱导金针菇液态菌丝，测量菌丝中精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白含量从而初步探讨衣康酸对于金针菇的品质调控的影响。方案论证（一）方案原理（1）生物信息学分析。生物信息学是计算机学科与生物学科相互融合后产生的交叉学科，旨在利用计算机准确、快速的特点对庞大复杂的生物信息进行检索、分析、储存。它主要应用在基因组学与蛋白质组学的研究中，通过检索、分析互联网上各种数据库中的生物信息，可以较为准确得对未知蛋白质进行结构和功能预测、不同物种中同一基因序列的同源性分析，构建进化树（2）通过沉默基因，构建沉默载体来研究该沉默基因的功能。将某个或某些执行某种功能的基因通过生物技术手段让其降低表达效率或不发挥功能，并与空白对照的生理水平相比较，可以初步探究该沉默基因的功能。沉默基因的手段有很多，本文采用构建沉默载体的方法，将沉默载体转入宿主细胞中，在转录水平上降低宿主细胞对目的基因的表达，从而探究沉默基因的功能（3）外源诱导物诱导野生型金针菇液态菌丝发酵来探究该诱导物对野生型金针菇氨基酸含量的影响。本文中外源诱导物为不同浓度衣康酸，在食用菌发酵过程中添加不同的诱导剂来促进其生长发育或者次级代谢产物的积累的研究有很多例如，植物激素可显著提高双孢蘑菇的菌丝生长速度。利用不同浓度衣康酸诱导下金针菇菌丝中精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白含量变化可以初步探究金针菇品质调控的途径（二）方案内容（1）不同浓度衣康酸诱导野生型金针菇液态菌丝发酵，测量菌丝中精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白含量，探究衣康酸对金针菇生物学功能的影响（2）金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白的生物信息学分析利用expasy网站进行金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白的基本理化性质预测分析；利用预测的金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白序列进行BLASTP比对NCBI的Non-redundant protein sequences (nr) 数据库，分析金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白的功能域；利用softberry网站进行金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白的亚细胞定位预测；使用MEGA 7.0软件进行金针菇ADI1、TAD1基因编码蛋白系统进化树的构建（3）金针菇ADI1、TAD1沉默载体的构建通过同源性比对获取金针菇中编码ADI1、TAD1的基因克隆，设计沉默引物；通过分子生物学手段构建金针菇ADI1、TAD1基因沉默载体（三）理由及特点宏观上利用不同浓度衣康酸作为诱导剂，诱导金针菇液态菌丝发酵，探讨衣康酸对金针菇品质调控的影响；微观上通过生物信息学分析以及构建金针菇ADI1、TAD1基因沉默载体，验证了实验方案的可行性和可操作性，因此较为全面地探究了衣康酸在金针菇中的生物学功能。1 材料与方法1．1 实验材料1．1．1 实验菌株 金针菇母种为Fv-3，现保藏在大学生命科学学院食药用真菌遗传与育种实验室。菌种于4 ℃冰箱保藏至PDA培养基斜面。 1．1．2 培养基的配置 （1）CYM培养基试剂使用量麦芽糖1%葡萄糖2%酵母提取物（Yeast Extract）0.2%蛋白胨（Peptone）0.2%七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.05%磷酸氢二钾（K2HPO4）0.46%如果是固体培养基，就再加入2g琼脂条（2）LB培养基试剂使用量胰蛋白胨（Tryptone）1%酵母提取物（Yeast Extract）0.5%NaCl1%蛋白胨（Peptone）0.2%pH7.0，若配置固体培养基，则再加入2g琼脂条（3）PDA马铃薯固体培养基（1L）试剂使用量（g）马铃薯200葡萄糖20琼脂201．1．3 主要实验仪器超净工作台，ABI 2720型PCR仪，DYY-10C型电泳仪，水浴锅，DYCZ-20B型电泳槽，凝胶电泳成像仪，Eppendorf Centrifuge 5417R型台式低温高速离心机冰箱，恒温培养箱，摇床。1．2 实验方法1.2.1不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝发酵常见的精氨酸的测定方法主要是坂口试剂法，该方法原理为精氨酸中的侧链胍基在碱性条件下与α-萘酚反应，生产红色产物。通过分光光度计检测其光密度值。赖氨酸检测方法为茚三酮法，其主要原理是当赖氨酸与茚三酮在一定的酸性条件下，添加了铁离子或者铜离子等抑制剂，导致在480 nm吸光度值处有峰的其他氨基酸与茚三酮反应得到抑制，提高了茚三酮溶液与赖氨酸反应的特异性。（一）制备液体种子使用打孔器在活化好的金针菇平板种上打孔，用接种针随机挑取8个菌块接种于装有100 mL CYM液体培养基的250 mL锥形瓶中，150 rpm置于摇床，25 ℃培养5天。（二）二次摇瓶发酵使用打种机将制备好的液体种子进行无菌破碎，制成匀浆，接种于装有100 mL CYM液体培养基的摇瓶中，每瓶接种量3 %，摇床150 rpm，25 ℃培养5天。（三）配置1M的衣康酸溶液 使用去离子水配置1M的衣康酸溶液10ml（四）设置衣康酸浓度梯度诱导液态菌丝发酵按照0 µM、100µM、500µM、1000µM的衣康酸浓度梯度接种，每个梯度4个重复，摇床150 rpm，25 ℃培养5天。将锥形瓶中的金针菇菌丝收集到滤网中，用自来水冲洗，洗去菌丝表面培养基及多糖残留，将冲洗好的菌丝均匀的涂布于无纺布上（底部铺上吸水纸），放入60 ℃烘箱内，烘至恒重，研磨待用。1.2.2不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝精氨酸含量测定测定所用的试剂有1.2 M NaOH溶液、8 g/L α-萘酚/正丙醇溶液、0.5 mL/L双乙酰/正丙醇溶液等，具体方法如下（1）收集菌丝体后于60 oC烘箱内烘干，将烘干的菌丝体研磨成粉，放入2 mL的离心管中保存（2）准确称取0.05 g样品粉末于2 mL离心管中，加去离子水2 mL，颠倒混匀后，超声2 h（期间每15 min上下翻动摇匀离心管，使破碎更加彻底）后，12000 rpm离心10 min后，取上清液。（3）取1.5 mL离心管，依次加入200 μL的1.2 mol/LNaOH溶液、200 μL 0.006 mol/L双乙酰/正丙醇、400 μL的0.05 mol/L α-萘酚/正丙醇，最后加入20 μL样品上清液，混匀（4）将混匀后的离心管放入30 ℃水浴锅中，水浴15 min后冷却至室温（5）取离心管中200 μL反应液到酶标板中，使用酶标仪测定535 nm处的吸光度值1.2.3不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝赖氨酸含量测定（1）收集菌丝体后于60 oC烘箱内烘干，将烘干的菌丝体研磨成粉，放入2 mL的离心管中保存。（2）准确称取0.05 g样品粉末于2 mL离心管中，加2 mL去离子水，混匀后，超声2 h（期间每15 min上下翻动摇匀离心管，使破碎更加彻底）后，12000 rpm离心10 min后，取上清液。（3）取1.5 mL离心管，依次加入pH= 2.2柠檬酸缓冲液100 μL、50％乙二醇乙醚水溶液200 μL、2 % CuSO4水溶液200 μL、1 %茚三酮水溶液300 μL，最后加入100 ul样品上清液，每加入一种试剂后充分混匀。（4）将混匀后的离心管放入沸水浴锅中，水浴35 min后冷却至室温。取离心管中200 μL反应液到酶标板中，使用酶标仪测定480 nm处的吸光度值。1.2.4不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝水溶蛋白的测定方法（1）收集菌丝体后于60 oC烘箱内烘干，将烘干的菌丝体研磨成粉，放入2 mL的离心管中保存。（2）准确称取0.05 g于2 mL离心管中，加2 mL去离子水，混匀后，超声2 h（期间每15 min上下翻动摇匀离心管，使破碎更加彻底）后，12000 rpm离心10 min后，取上清液。（3）在酶标板中依次加入40 ul样品上清液和200 ul考马斯亮蓝，使用酶标仪测定595 nm处的吸光度值。1.2.5统计分析法以上所有的实验均设置三个重复，取平均值作为最终的金针菇液态菌丝精氨酸、赖氨酸和总蛋白的含量。对实验数据进行显著性分析。1.2.6 金针菇TAD1基因的获取以及TAD1基因编码的蛋白的生物信息学分析利用玉米黑粉菌（U. maydis）、炭疽菌（Colletotrichum sidae）的TAD1基因序列比对金针菇基因组库，获得金针菇的TAD1基因序列（Gene2069）对金针菇TAD1基因编码的蛋白进行生物信息学分析（1）对金针菇TAD1基因编码蛋白进行氨基酸残基数、理论等电点和分子量预测。(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)。将预测的金针菇TAD1基因编码蛋白序列进行BLASTP比对NCBI的Non-redundant protein sequences (nr) 数据库，分析金针菇TAD1基因编码蛋白的功能域。（2）金针菇TAD1基因编码的蛋白的亚细胞定位。使用softberry网站(http://www.softberry.com/)对该蛋白的亚细胞定位预测分析； （3）金针菇TAD1基因编码蛋白的系统进化树的构建利用CLUSTALW对金针菇(F. velutipes)、绒柄裸脚菇（Gymnopus luxurians）、暗蓝光盖伞（Psilocybe cyanescens）、蜜环菌（Armillaria gallica）、玉米黑粉菌（U. maydis）等真菌的TAD1基因进行多重分析比较。系统进化树使用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-joining法进行构建(1000 bootstrap repetitions)1.2.7金针菇ADI1基因的获取以及ADI1基因编码的蛋白的生物信息学分析利用玉米黑粉菌（U. maydis）、绣球菌（Sparassis crispa）的ADI1基因序列比对金针菇基因组库，获得金针菇的ADI1同源序列（Gene4509）。对金针菇ADI1基因编码的蛋白进行生物信息学分析（1）对金针菇ADI1基因编码蛋白进行氨基酸残基数、理论等电点和分子量预测(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)。将预测的金针菇ADI1基因编码蛋白序列进行BLASTP比对NCBI的Non-redundant protein sequences (nr) 数据库，分析金针菇ADI1基因编码蛋白的功能域。（2）金针菇ADI1基因编码的蛋白的亚细胞定位使用softberry网站(http://www.softberry.com/)对该蛋白的亚细胞定位预测分析； （3）金针菇ADI1基因编码蛋白的系统进化树的构建利用CLUSTALW对金针菇(F. velutipes)、绒柄裸脚菇（G. luxurians）、玉米黑粉菌（U. maydis）、干酪菌属（Piloderma croceum）等真菌的ADI1基因进行多重分析比较。系统进化树使用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-joining法进行构建(1000 bootstrap repetitions)1.2.8金针菇TAD1、ADI1沉默载体的构建（一）金针菇总RNA的提取和cDNA的制备（1）收集平板培养的菌丝，液氮研磨后，加入800 μL的RNAiso Plus裂解细胞，剧烈摇晃后冰浴5分钟（2）12000 rpm，4 ℃离心5分钟，将上清转移至新的离心管中，加入0.2 mL的氯仿，上下颠倒混匀后冰上静置5分钟，12000 rpm，4 ℃离心15分钟，看到溶液分层，吸取上清液（3）上清液中国加入300 μL异丙醇，上下颠倒混匀后冰上静置10 分钟（4）12000 rpm，4 ℃离心10分钟，加入70 %乙醇400 μL，4 ℃，12000 rpm离心5分钟，冰上干燥3分钟，加入30 μL的超纯水，用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳验证，于-70 ℃保存试剂使用量Total RNA12 μLAccurt Reaction Mix4 μL42℃ 2min或者室温5minAccuRT Reaction stopper（5x）4 μL5x A1l-in-one RT Master Mix8 μLNuclease free water12 μL25℃水浴 10 min；42℃ 水浴50 min；85℃ 变性5min稀释5倍后用于qRT-PCR（二）设计金针菇ADI1和TAD1基因全长序列引物通过与cDNA序列进行比对得到金针菇ADI1和TAD1的全长序列并用Primer5.0设计目的基因沉默片段的特异引物沉默引物为TAD1i-F1:ACTGGGTACCATTTCTGAACGCCATACTAD1i-R1:ACTGACTAGTCCTACCGTCGTGAGCADI1i-F2:ACTGGGTACCAAACTGCGGAAACCTADI1i-R2:ACTGACTAGTTGGGCTGAGCATCTAC（三）PCR扩增金针菇ADI1和TAD1沉默片段根据要求用ddH2O稀释粉末状引物，根据设计的引物，PCR扩增金针菇ADI1和TAD1沉默片段。PCR反应体系试剂使用量引物F1 μL引物R1 μL10xBuffer2.5 μLdNTPs Mixture2 μLcDNA模板1 μLddH2O17.3 μLrTaq DNA polymerase0.2 μLTotal25 μLPCR扩增程序94℃5 min94℃30 s55℃30 s72℃30 s72℃10 min进行30个循环，结束后，用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测，完成第一轮筛选。（四）金针菇ADI1和TAD1沉默片段的PCR产物回收金针菇ADI1和TAD1沉默片段的PCR产物回收使用的是生工Sanprep胶回收试剂盒（1）制作电泳回收胶，将沉默片段对应的跑胶获得的条带，切割下来放入离心管做好标记备用。（2）向离心管中加入450 μL的Buffer B2，50 ℃水浴5-10 min，直至胶块融化（3）将溶胶液倒入吸附柱中，放入新的收集管，8000 rpm，离心30秒，弃废液（4）向吸附柱内加入500 μL Wash Solution，9000 rpm，离心30秒，弃废液（5）重复步骤4（6）空吸附柱于9000 rpm离心1分钟（7）取一个干净的1.5 mL离心管放入吸附柱，向吸附膜的中央加30 μL Elution Buffer，室温静置1分钟后离心1分钟，将离心后的离心管做好标记并保存与4 ℃冰箱中备用（五）金针菇ADI1和TAD1沉默片段的PCR产物T-A连接酶连体系试剂使用量ddH2O3 μLT4 Buffer1 μLPCR纯化产物4 μLPMD19-T vector1 μLT4 DNA连接酶1 μLTotal10 μL按照上表加好酶连体系，充分混匀后，4 ℃过夜孵育。（六）转化（1）取100 μL感受态细胞于冰盒上静置融化，加入酶连产物，摇匀，置于冰上放置30 min（2）42 ℃水浴锅热激45 s，冰上放置1 min，加入LB液体100 μL于37 ℃摇床1小时（3）涂布于LB+Amp的平板上，37 ℃过夜培养（每100 mlLB加入100 ulAmp）（4）每个培养皿随机选取8个单菌落，选取设计好的引物进行菌液PCR扩增，并电泳检测扩增结果。（5）根据目标PCR片段的大小和条带位置挑选阳性转化子送测序。根据测序结果，选取合适的转化子，进行质粒的提取或者保存于40 %的无菌甘油中。PCR扩增体系试剂 使用量引物F1 μL引物R1 μL10xBuffer2.5 μLdNTPs2 μL菌液1 μLddH2O17.3 μLrTaq DNA polymerase0.2 μLTotal25 μLPCR扩增程序94℃5 min94℃30 s55℃30 s72℃30 s72℃10 min进行30个循环（七）碱裂解法提取酶连质粒（1）在无菌离心管中加入LB+Amp液体培养基4 mL，挑取单菌落混入培养基中，于37 ℃摇床过夜培养。（2）将菌液转入2 mL离心管，12000 rpm，离心1分钟，弃上清。（3）加100 μL溶液Ⅰ（葡萄糖 4.730 g、Tris-HCl pH=8.0 25 mmol/L 12.5 mL、0.5 M EDTA pH=8.0 16 mL，加水至500 mL），剧烈震荡，充分悬浮菌体。（4）加150 μL溶液Ⅱ（2 mol/LNaOH 0.5 mL、10 % SDS 0.5 mL、ddH2O 4 mL），温和震荡，冰上放置5 分钟。（5）加150 μL溶液Ⅲ（5 mol/L 乙酸钾 60 mL、冰乙酸 11.5 mL/ddH2O 28.5 mL），-20 ℃放置10分钟。（6）12000 rpm，离心10 分钟，吸取400 μL上清转入新的离心管。（7）向离心管中加入等体积400 μL酚氯仿异戊醇（25:24:1）混匀3-5次，摇匀（8）12000 rpm 离心8分钟，吸取350 μL上清至离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，静置于-20 ℃，20分钟。（9）12000 rpm，离心5分钟弃上清，加600 μL预冷70 %乙醇，混匀12000 rpm，离心3分钟离心弃上清，置于37 ℃恒温箱5分钟。（10）加入30 μL ddH2O和1 μLRNase溶解于37 ℃，30分钟，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，菌液保存于-20 ℃冰箱。（八）酶连质粒的酶切与回收酶切体系试剂使用量ddH2O8 μL10xM Buffer2 μL目的片段8 μLKpnⅠ1 μLSpeⅠ1 μLTotal20 μL37 ℃温箱静置4小时后进行琼脂糖凝胶电泳，按照上述胶回收步骤进行胶回收。（九）金针菇ADI1和TAD1沉默基因片段与沉默载体酶连酶连体系试剂使用量ddH2O3 μL10x T4 DNA Ligase Buffer1 μLFv-GPiE酶切产物4 μL酶切后的目的片段1 μLT4 DNA Ligase1 μLTotal10 μL将酶连体系放入4 ℃冰箱，过夜。（十）转化与测序对酶连产物进行转化，过程参照上述转化步骤。将琼脂糖凝胶电泳后有条带的样品送测，送测结果出来后，再次用Bioedit将其与目的基因的沉默片段进行比对，若与T-A连接后测序结果无差异，则沉默载体构建成功（十一）分装保存菌液与金针菇ADI1和TAD1沉默载体（1）取测序结果成功的样品，在无菌条件下分装500 μL于无菌离心管中，并加入相同体积（500 μL）甘油，标记贮存在-70 ℃（2）将测序成功菌液提质粒，保存两管2 结果与分析2.1不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇菌株赖氨酸、精氨酸、水溶蛋白含量测定2.1.1绘制野生型金针菇菌株精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白的标准曲线根据实验方法测定0.2 mg/mL-1.0 mg/mL的野生型金针菇菌株精氨酸含量得到的OD值，得到回归方程为y =0.2916x+0.1127，相关系数R² = 0.9905；根据实验方法测定0.2 mg/mL-1.0 mg/mL的野生型金针菇菌株赖氨酸含量得到的OD值，得到回归方程为y = 0.6926x-0.05107，相关系数R² = 0.9961。根据实验方法测定0 mg/mL-0.1 mg/mL的野生型金针菇菌株水溶蛋白含量得到的OD值，做出线性回归方程为y=2.846x+0.3906，且相关系数为R2=0.9959。2.1.2野生型金针菇菌株赖氨酸、精氨酸、水溶蛋白含量变化利用坂口试剂法和茚三酮法对不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇菌株精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白的含量进行测定，分别进行四个重复，并进行显著性分析。空白对照组中，精氨酸含量为20.29 mg/g，赖氨酸含量为28.82 mg/g，水溶蛋白含量为192.47 mg/g；加入0.1 mM衣康酸实验组中，精氨酸含量为22.02 mg/g，赖氨酸含量为28.42 mg/g，水溶蛋白含量为241.33 mg/g；加入0.5 mM衣康酸实验组中，精氨酸含量为24.21 mg/g，赖氨酸含量为28.14 mg/g，水溶蛋白含量为244.39 mg/g；加入1 mM衣康酸实验组中，精氨酸含量为26.77 mg/g，赖氨酸含量为29.79 mg/g，水溶蛋白含量为255.82 mg/g// /图1 不同浓度衣康酸诱导下精氨酸、赖氨酸、水溶蛋白含量变化比较Fig.1 Comparison of arginine、lysine and water soluble protens content at different itaconic acid concentrationsA.不同浓度衣康酸诱导下精氨酸含量变化比较 B.不同浓度衣康酸诱导下赖氨酸含量变化比较 C.不同浓度衣康酸诱导下水溶蛋白含量变化比较A.Comparison of arginine content at different itaconic acid concentrations B.Comparison of lysine content at different itaconic acid concentrations C. Comparison of water soluble protens content at different itaconic acid concentrations由图1可知，加入0.5 mM和1 mM衣康酸后对金针菇精氨酸含量的影响显著，但是所有浓度的衣康酸诱导对赖氨酸含量的影响不显著。加入0.1 mM和0.5 mM衣康酸对金针菇水溶蛋白含量的影响显著。因此，在金针菇液态菌丝中加入0.5 mM衣康酸作为诱导剂，可以显著提高金针菇菌丝体中精氨酸含量和水溶蛋白含量。猜测原因可能是衣康酸的加入为金针菇体内精氨酸的合成提供了碳源。2.2金针菇ADI1和TAD1全长基因及其编码蛋白的基本特性分析金针菇ADI1基因序列编号4509，序列全长930 bp，其编码的蛋白残基数309，理论等电点5.13，蛋白分子量32.6 kD；金针菇TAD1基因序列编号2069，序列全长1431 bp，其编码的蛋白氨基酸残基数476，理论等电点6.44，蛋白分子量53.5 kD表1 金针菇ADI1和TADI基因编码蛋白的基本理化性质分析Table 1 Analysis of basic physical and chemical properties of protein encoded by the ADI1 and TADI genes of the F. velutipes基因序列编号基因长度Gene length (bp)氨基酸残基数The number of amino acid residues理论等电点Theoretical Isoelectric Point蛋白分子量molecular weight (kD)Gene206914314766.4453.5Gene45099303095.1332.62.3金针菇TAD1和ADI1基因编码的蛋白的亚细胞定位预测 对金针菇TAD1和ADI1基因编码的蛋白亚细胞定位预测。结果如下表所示表2 金针菇ADI1和TADI基因编码蛋白的亚细胞定位预测Table 2 Prediction of subcellular localization of proteins encoded by the ADI1 and TADI genes of the F. velutipes亚细胞定位Subcelluar localization细胞核nucleus细胞质Cytoplasm溶酶体lysosome线粒体基质MitochondrialMatrix space 微体（过氧化物酶体）Microbody(peroxisome)质膜Plasma membraneTAD1 Gene20690.6000.0000.2100.1000.3590.000ADI1Gene45090.0000.6500.2760.1000.0000.100由表2可知，金针菇反式乌头酸脱羧酶的定位在细胞核，金针菇异构酶定位在细胞质，与理论预期相符。2.4金针菇TAD1和ADI1基因编码的蛋白结构域分析针对金针菇TAD1基因编码蛋白的结构域分析，结果见图/图2 金针菇TAD1编码蛋白的结构域分析Fig.2 Analysis of protein domain coded by TAD1 in F. velutipes由图2可知PRK 08937代表腺苷酸琥珀酸裂解酶结构域，ADSL_C结构代表腺苷酸琥珀酸裂解酶的C末端结构，该蛋白可能属于类I类裂解酶超家族，该超家族包括Ⅰ类裂解酶、组氨酸氨裂解酶和苯丙氨酸解氨酶，主要参与催化β-消除反应，是同源四聚体蛋白。针对金针菇ADI1基因编码蛋白的结构域分析，结果见图/图3 金针菇ADI1编码蛋白的结构域分析Fig.3 Analysis of protein domain coded by ADI1 in F. velutipes由图3可知该蛋白属于PrpF蛋白超家族，PrpF是在2-甲基柠檬酸盐途径中发现的一种蛋白质.它的结构类似于脯氨酸消旋酶，这类蛋白主要作用于顺式乌头酸与反式乌头酸之间的互变异构。2.5金针菇TAD1和ADI1基因编码蛋白的进化关系将金针菇TAD1和ADI1基因和其他真菌中已报道的TAD1和ADI1基因序列构建系统进化树，结果如图所示/图4 金针菇TAD1基因编码蛋白进化树的构建Fig.4 Construction of TAD1 gene encoding protein evolutionary tree in F. velutipes由图4可知，金针菇TAD1和担子菌伞菌目的蜜环菌（Amillaria）具有较近的亲缘关系/图5金针菇ADI1基因编码蛋白进化树的构建Fig.5 Construction of ADI1 gene encoding protein evolutionary tree in F. velutipes由图5可知，金针菇ADI1基因与担子菌干酪菌属的污叉丝孔菌（Dichomitus squalens）具有较近的亲缘关系2.6构建金针菇TAD1和ADI1基因沉默载体 以金针菇的cDNA为模板，用设计好的引物进行PCR扩增，得到400 bp左右的片段，与理论PCR产物片段大小相一致，说明PCR扩增成功。如图所示图6 金针菇ADI1、TAD1沉默基因片段的克隆，A1、A2代表ADI1沉默基因片段，T1、T2代表TAD1沉默基因片段，M是MarkerFig.6 Cloning of ADI1 and TAD1 silencing gene fragments of F. velutipes，A1、A2 represent the ADI1 silencing gene fragments, T1、T2 represent the ADI1 silencing gene fragments，M is Marker将上述PCR产物进行回收，再将回收产物与T载体连接，转化到感受态细胞之后使用设计好的引物进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳，在400 bp左右有片段，与目标基因大小一致，所以初步说明连接T载体成功，挑选阳性转化子送生物公司测序/图7 T载体菌液PCR验证，M是Marker，A1、A2代表ADI1沉默基因片段连T载体，T1、T2代表TAD1沉默基因片段连T载体Fig.7 Bacterial liquid PCR verification electrophoresis，M is Marker，A1、A2 represent the ADI1 silencing gene fragments Connect T carrier, T1、T2 represent the ADI1 silencing gene fragments Connect T carrier测序结果用Bioeidt比对显示连接T载体成功，可以进行后续的实验。将实验室构建的Fv-GPiE进行双酶切，得到PMI沉默载体，从电泳图可以看出，样品在2000 bp以上有条带，这初步说明质粒被酶成功地切开了，酶切成功，我们需要的是如图所示片段，将其进行胶回收。/图8 pmi载体酶切验证电泳图Fig.8 pmi vector digestion verification electrophoresis将连接了T载体的TAD1和ADI1基因片段进行双酶切，在400 bp左右有条带，大小与TAD1和ADI1基因片段大小一致，取该片段胶回收。用T4连接酶将酶切成功的基因片段和沉默载体进行连接，从电泳图可以看出，在400 bp左右可以看到单一的目标条带，说明酶连成功。对酶连产物进行转化，并进行PCR验证。/图9 金针菇TAD1、ADI1沉默载体菌液PCR验证，M为Marker， A1、A2代表ADI1沉默载体，T1、T2代表TAD1沉默载体Fig.9 PCR verification of TAD1 and ADI1 silencing carrier bacteria solution of F. velutipes，M is Marker, A1 、A2 represent the silent carrier of ADI1, T1 、T2 represent the silent carrier of TAD1将琼脂糖凝胶电泳后有条带的样品送生物公司测序。把这个测序的结果与连接T载体之后的测序结果比对，发现这两个结果一致，说明金针菇AMPK的沉默载体构建成功，保存菌液和质粒3 讨论 金针菇由于含有丰富的赖氨酸和精氨酸而广受人们喜爱，随着生物技术的发展，如何利用特异性基质和生物工程手段来提高金针菇中精氨酸和赖氨酸含量成为金针菇品质调控的研究热点。衣康酸是生物体三羧酸循环的中间产物，我们认为或许可以通过生物技术手段调控衣康酸在金针菇体内的含量，来调控金针菇的能量代谢，从而间接影响金针菇的氨基酸代谢，最终达到提高金针菇体内赖氨酸和精氨酸含量的目的。 由于已报道的文章中普遍认为衣康酸是由它的关键合成酶顺乌头酸脱羧酶CAD脱羧而来，于是我们计划从衣康酸的关键合成酶顺乌头酸脱羧酶开始着手研究。然而我们在金针菇基因组库中并未筛选到顺乌头酸脱羧酶基因CAD，通过查阅文献，我们发现在担子菌中，真菌利用区别于子囊菌土曲霉的另外一条衣康酸生物合成途径来合成衣康酸，于是我们及时变换了研究思路，最终在金针菇基因组库中分别筛选到了金针菇TAD1和ADI1目的基因，在接下来的实验中，我们成功了构建金针菇TAD1和ADI1基因的沉默载体，但由于特殊原因，后续的沉默菌株荧光定量PCR和沉默菌株赖氨酸、精氨酸含量的测量实验终止。后续我们补上了金针菇ADI1和TAD1两种基因的生物信息学分析。通过在金针菇基因组库中筛选出的ADI1、TAD1基因的生物信息学分析，我们发现，金针菇ADI1基因与担子菌干酪菌属的污叉丝孔菌具有较近的亲缘关系，基因全长930 bp，序列编号4509，其编码的蛋白属于PrpF蛋白家族，该类蛋白主要负责参与顺式乌头酸和反式乌头酸的互变异构，属于异构酶；蛋白亚细胞定位预测定位在细胞质中，与我们查阅到的文献描述相符。另一个筛选到的金针菇TAD1基因与担子菌蜜环菌具有较近的亲缘关系，基因全长1431 bp，序列编号2069，编码蛋白亚细胞定位预测在细胞核中，通过对该编码蛋白进行结构域分析，发现其C末端含有腺苷琥珀酸裂解酶结构域，属于类I类裂解酶超家族。此时我们已经发现，在担子菌金针菇中，TAD1基因与子囊菌土曲霉CADA基因显著不同，子囊菌土曲霉CADA基因与真核和原核生物的PrpD家族的甲基柠檬酸脱水酶有关。通过查阅文献我们发现，有研究者通过荧光显微镜技术定位了玉米黑粉菌细胞中的ADI1和TAD1编码蛋白，结果显示玉米黑粉菌中TAD1编码蛋白在细胞核与细胞质中均有出现。其研究团队发现玉米黑粉菌TAD1基因编码蛋白与原核生物CMLE蛋白具有高度相似性，于是我们通过NCBI数据库搜索原核生物CMLE蛋白，发现该蛋白也属于类I类裂解酶超家族。从系统进化树来看，金针菇TAD1基因编码蛋白与原核生物毛色二孢菌比与真菌蜜环菌的亲缘关系更近。这里我们验证了金针菇中TAD1基因编码蛋白具有反式乌头酸脱羧酶功能的可能性。且金针菇ADI1与TAD1基因均与我们查阅到的文献中使用的实验菌株玉米黑粉菌的TAD1和ADI1基因具有较高的序列相似性，这一结果证明在金针菇中确实是使用了一条不同于子囊菌土曲霉的衣康酸合成途径。意味着我们课题的研究思路是可操作的。在前期的实验过程中，我们还利用不同浓度的衣康酸来诱导金针菇液体菌丝的生长并分别测量了菌丝体内的赖氨酸、精氨酸和水溶蛋白的含量。测量结果表明，0.5 mM浓度的衣康酸对于金针菇精氨酸和水溶蛋白含量均有显著提高作用。我们猜想可能外源衣康酸的加入为金针菇体内合成精氨酸提高平了碳源。这一结果意味着我们最初设想的通过调控衣康酸的生物合成来调控金针菇的能量代谢，从而间接影响金针菇的氨基酸代谢，最终达到提高金针菇赖氨酸和精氨酸含量，提升金针菇品质的思路是可行的。有关金针菇ADI1和TAD1基因的存在我们还提供了一种设想。生物体内反式乌头酸是一种有毒中间体，ADI1基因的存在会导致这种有毒中间体不断产生并积累，因此生物体进化出了一条特有的解毒途径，利用TAD1基因分解反式乌头酸，使生物体内的顺式和反式乌头酸处于一种动态平衡。而这种解毒途径在许多人类致病菌中已有出现，这可能是金针菇TAD1基因与土曲霉CADA基因同源性较大差异的原因。本实验还有许多不足之处，我们没有构建金针菇TAD1和ADI1基因沉默菌株与检测沉默菌株体内精氨酸和赖氨酸氨基酸含量来与野生型金针菇菌株进行对比验证猜想。目前有关反式乌头酸脱羧酶的蛋白晶体结构、功能性质均未有发表，因此本实验仍需进一步做研究验证。致谢参考文献[1]于荣利,秦旭升,宋凤菊.金针菇研究概况[J].食用菌学报，2004. 11( 4): 63- 68.[2]刁治民,刘禹宏,田玉华.青海药用蕈菌[ M] .西宁: 青海人民出版社, 1994.[3]王文亮，徐同成，刘丽娜等.金针菇的保健功能及其开发前景[J].中国食物与营养，2011（7）18-19.[4]胡国元，李伟伟, 叶朝东.富硒金针菇发酵饮品的生产工艺[ J ].食品科学, 2001, 23( 12):77-80.[5] 孔祥辉，孙宇峰，任永春，等.金针菇免疫调节蛋白的研发与应用[J].生物技术，2006，（8）84-88.[6] 王启富．金针菇的采收与加工[J].农业与技术，2007（6）105-106.[7] Elena Geiser, Sandra K Przybilla, Alexandra Friedrich,et al.Ustilago maydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans‐aconitate. 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Microb Biotechnol, 2013(6): 453–492. 附录trans-aconitate decarboxylase (Tad1).反式乌头酸脱羧酶Gene2069atggacgactacaatacgtatcaaacgccactctcaagatttctgaacgccatacagaaccgcttctacacttggcgcaaactatggctcaatctagccatcgcagagaagcagcttggtcttcctatcacggacgccgccatagaacagatgaagaataatctaactttgaccccagagcagtttgacatcgctgcaaaggaggagaagaaacgtcgccacgatgtaatggctcatgtacacacctttgggatcgtcgccccagctgccgcgggcatcatccatctcggcgccacttcctgctacgtcacagacaatgccgacctcatctttctacgtgaaggactcgactatctcattcgctccttgtccgtcctgatctctcgcctctcgtccttcgcagcacagtatcgggatctgcccgctctgggattcactcatttccagcctgcccagctcacgacggtagggaaacgcgctacgctctggatccaggaattgctttgggacctccggaatatcaagcgtgctcgcgatgacctgggcttccgtggcgtcaagggaactaccggaacgcaagctagctttttagcccttttcgatggcgaccataaaaaggtcgaagacctggatgccctcgtcaccaagctttctggctttggatatgcctacccagtcacatcgcagacgtattctcgcaagattgacgtcgatgtcttagcaccactggcttccctcggcgcaagcgctcataaaatcgcaactgaccttcgtctactcgcaaatctcaaggaaatcgaagaacctttcgaatctacccagatcggttcgtcggctatggcctacaagcgcaatccaatgcgttccgagcgcgtctgcagtctctcgcggcacttaatggtgcttcaacaaaatgcgctcatgacgtcgagcgtgcaatggtttgaacgcacactagatgatagtgctaaccgccgcattaccctcccagaagcgtttttgacggcagacatagtcctatccaccctccagaatatctccgaaggacttgtagtctatcccaaagtcatcgcccgccgtatcagccaggagctcccctttatggccaccgaaaatctcatcatggccatcgtaaagaaaggtggagacagacaagaagctcatgagaaaatccgagttctgtcccatgaagcggctcatcaggtcaaacaacttggccttgagaacgacctcatcgctcgtgtcaaggctgacccgtacttcgactcgatcaaggctgatttagaaacactgttggacccgcagagttttatcggtcgtgcgccggaacaggtggatgcgtttctgagagattgggtggaacccgcgctcgctgatgagcagctacaagacgccattaaaaagtctgtcaaggttgacttgaatgtgtag沉默引物Tad1i-F1:ACTGGGTACC ATTTCTGAACGCCATACTad1i-R1:ACTGACTAGT CCTACCGTCGTGAGCaconitate-Δ-isomerase（Adi1） 异构化酶Gene4509atgggttctccagacagcagcgggcgacaattgaatggcatgggaggcggcatatccagtctttccaagatatgtgtcgtcgggccgcccaccgtggctaacgcagacgtggactatacctttgctcaggttggcatccaagacgactcggtggactatgcgggaaactgcggaaacctttcctccatgattggcgtcttcgcgctggatcaagggctcgtaggaccgttcacctcgtccagcagcgctactgtacgagcctataatacgaacactcgaaagatcatacggaccacattcccccttctcgatagtggcgtagctgacttggagcgtccagaccttcccatcgcgggcatacaaaggaaaggttcagccatcacaatggagtttctggacccggctggagcgggaaccggcgcacttcttccatccggctcgtcgtacgaccagctgagggtcggtagagattcagttcgcatgtctctggttgacgctaccaacccgactgtgttcgttgaggatgccgccttcgaactctttgcgcaaaaagatgttgctgagtattttcgacgagagggcgcgactttgatgaggttggaccctatggtagatgctcagcccaaggttgccttcattcgacaggcggagggtgacgatgcggatattgagatacgtgcctattcgatgggggttctgcacaaggcagtgccaatgacggtcgcattaggacttggggtcgcggcaaatgtccaagggactatcgcctatggtatgatgtctactcataatctggacggcattgttaggatcaagcatccgggtggcatagtgcatgttggggcaaatgtcgaggccgatggcaaagtacagagcgctaaggtgctcatgacaggacggaggcttatggaaggatcagtatattggtaa沉默引物Adi1i-F2:ACTGGGTACCAAACTGCGGAAACCTAdi1i-R2:ACTGACTAGTTGGGCTGAGCATCTAC
目录
摘要1
关键词1
ABSTRACT ..1
KEYWORDS .2
引言3
文献综述4.
方案论证5
1 材料与方法 .5
1.1 实验材料 .5
1.1.1 实验菌株..5
1.1.2 培养基的配制..5
1.1.3 主要实验仪器..6
1.2 实验方法.6
1.2.1 不同浓度衣康酸诱导的野生型金针菇菌株液态发酵..6
1.2.2不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝精氨酸含量测定...7
1.2.3不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝赖氨酸含量测定...7
1.2.4不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇液态菌丝水溶含量测定...7
1.2.5 统计分析方法..8
1.2.6 金针菇TAD1基因的获取以及TAD1基因编码的蛋白的生物信息学分析..8
1.2.7 金针菇ADI1基因的获取以及ADI1基因编码的蛋白的生物信息学分析8.
1.2.8 金针菇TAD1、ADI1沉默载体的构建13
2 结果与分析...13
2.1 不同浓度衣康酸诱导下野生型金针菇菌株赖氨酸、精氨酸、水溶蛋白含量测
定..13
2.1.1 绘制野生型金针菇菌株精氨酸、赖氨酸和水溶蛋白的标准曲线13
2.1.2 野生型金针菇菌株赖氨酸、精氨酸、水溶蛋白含量变化13
2.2 金针菇ADI1和TAD1全长基因及其编码蛋白的基本特性分析14
2.3 金针菇TAD1和ADI1基因编码的蛋白的亚细胞定位预测14
2.4 金针菇TAD1和ADI1基因编码的蛋白结构域分析15
2.5 金针菇TAD1和ADI1基因编码蛋白的进化关系16
2.6 构建金针菇TAD1和ADI1基因沉默载体 ..18
讨论...20
致谢...22
参考文献...22
附录...23
衣康酸及其关键合成酶顺乌头酸脱羧酶在金针菇能量代谢以及氨基酸代谢中的调控作用
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606494.html
