3-溴-4-羟基苯甲酸(3-bromo-4-hydroxybenzoate, BHB)作为一种重要的化工中间体，广泛用于合成和生产染料、医药、农药等工农业产品。已在不同环境中检测到BHB的存在，对生态环境安全和人类健康具有潜在的威胁。前期研究发现菌株 Pigmentiphaga sp. H8 能够矿化BHB，并能以其为唯一碳源和能源生长，证实了基因簇phbh2pcaA2B2参与BHB的降解，且该基因簇的转录表达受BHB诱导。在降解基因簇phbh2pcaA2B2上游存在一个MarR家族的转录调控基因orfR2，推测其参与该降解基因簇的转录调控。因此，本研究以菌株 H8 中BHB降解基因簇phbh2pcaA2B2上游的转录调控元件基因orfR2为研究对象，通过验证转录调控元件基因orfR2的功能，鉴定转录调控单元和转录起始位点、确定转录激活的效应物、鉴定启动子结合位点和OrfR2的四级结构，最终从分子水平阐明OrfR2对BHB降解基因簇phbh2pcaA2B2的转录调控机制，丰富卤代芳烃化合物代谢调控的理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试剂与培养基 2
1.2菌株、质粒和引物3
1.3调控元件基因orfR2的功能鉴定4
1.4细菌RNA提取4
1.5转录激活效应物的鉴定4
1.6转录单元和转录起始位点鉴定5
1.7 调控因子OrfR2的表达与纯化5
1.8 凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）5
1.9 DNaseⅠ足迹实验 6
1.10调控元件OrfR2四级结构的鉴定6
2 结果与分析6
2.1 转录调控元件基因orfR2的功能鉴定6
2.2转录激活效应物的鉴定7
2.3转录单元的鉴定7
2.4 转录起始位点的鉴定8
2.5 OrfR2的异源表达与纯化8
2.6 OrfR2的凝胶阻滞实验结果8
 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
2.7 DNaseⅠ足迹实验结果9
2.8 鉴定OrfR2的四级结构9
3 讨论10
致谢11
参考文献11
菌株Pigmentiphaga sp. H8中3溴4羟基苯甲酸代谢的调控机理
引言
转录调控是细菌为了适应环境变化而进化出的一种有效调节基因转录表达的手段[1]。在有毒污染物的降解研究中发现，降解基因的转录调控十分常见，这种方式使得细菌可以高效管理降解基因的转录和表达，降低无选择压力时降解基因转录产生的适应性成本。为了应对复杂污染环境，细菌进化出了多种精妙的转录调控系统[2]，常见的有LysR、IclR、GntR、AraC/XylS、XylR/NtrC、TetR、MarR和FNR等家族。本研究主要关注MarR家族的转录调控元件。
MarR家族的转录调控元件是调节多种抗生素抗性操纵子的基因的阻遏物[34]。该家族调控元件一般比较小（17~22 kDa），且其氨基酸序列之间呈现很高的差异性，但它们都具有类似的三角形拓扑结构[57]。这类蛋白与其他调控元件不同的是，与DNA结合HTH区域位于蛋白的中间区域，而非N端或者C端。MarR家族的调控因子通常以二聚体形式存在，以MTH313为例，晶体结构数据表明该调控元件每个单体由6个α螺旋和23个β折叠组成，通过前一个单体N端超螺旋和后一个单体C端超螺旋进行结合形成二聚体发挥功能[8]。
已报道的绝大部分MarR家族的调控元件都是作为阻遏蛋白参与污染物降解的调控，当无效应物存在时，通过与被调控基因的启动子内一段DNA回文序列结合，抑制被调控基因（簇）的转录与表达；当存在效应物时，效应物与调控元件结合促使其构型发生改变，进而从启动子的回文区脱离，解除阻遏作用，激活被调控基因的转录翻译。参与污染物降解的阻遏型MarR调控元件有调控氯苯甲酸代谢基因簇cbaABC转录的阻遏蛋白CbaR[9]，调控3羟基苯甲酸羟化酶基因转录的阻遏蛋白MobR[10]以及调控氨基苯酚代谢基因簇转录的阻遏蛋白NbzR[11]等。MarR家族中除了阻遏型的调控元件，还存在极少数的激活型转录调控因子，比如在玫瑰链霉菌Staphylococcus aureus NRRL11379中的DptR3通过改变基因簇dpt结构基因的转录间接激活达托霉素的生物合成和形态分化[12]；在菌株Rhodopseudomonas palustris CGA009 中BadR通过结合苯甲酰辅酶A（benzoylcoenzyme A）来调控基因簇bad结构基因的转录和表达来促进苯甲酸酯的降解[13]。
实验室前期研究发现菌株 Pigmentiphaga sp. H8 能以 3溴4羟基苯甲酸（BHB）为唯一的碳源和能源进行生长，而且菌株H8体内存在两条参与BHB代谢的基因簇phbh1pcaAB和phbh2pcaA2B2，其中PHBH1和 PHBH2都是诱导型表达（图1）。phbh2pcaA2B2降解基因簇中存在一个MarR家族的转录调控因子基因orfR2，我们推测：OrfR2调控BHB降解基因簇phbh2pcaA2B2的转录和表达。因此，本研究以菌株 H8 中BHB降解基因簇phbh2pcaA2B2上游的转录调控元件基因orfR2为研究对象，通过验证转录调控元件基因orfR2的功能，鉴定转录调控单元和转录起始位点、确定转录激活的效应物、鉴定启动子结合位点和OrfR2的四级结构，最终从分子水平阐明OrfR2对BHB降解基因簇phbh2pcaA2B2的转录调控机制，丰富卤代芳烃污染物代谢调控的理论基础。


图1 菌株 Pigmentiphaga sp. H8中BHB的代谢途径（A）及其降解基因簇（B）
Figure 1 Degradation pathways (A) and related degradation gene cluster (B) of BHB in PigmentIphaga sp. strain H8
1 材料与方法
1．1 试剂与培养基
基础盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 1.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2；0.2％酵母粉基础盐培养基（YMS）：2g酵母膏，NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 1.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2；LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 ml，pH 7.2±0.2。固体培养基中需加入2%琼脂。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606490.html