3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate, BHB）是一种重要的化工中间体，并在环境中经常被检出。BHB的微生物降解研究极少，其降解机制的研究匮乏。因此，挖掘新的BHB降解关键酶，研究其酶学特性和催化机理具有重要的科学意义。本研究前期在BHB的矿化菌株Pigmentiphaga sp. H8中发现3个冗余的4-羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh1、phbh2和phbh3），并初步证实phbh1和phbh2主要负责BHB降解，而phbh3主要参与4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate, 4-HB）的代谢。本研究将研究3个冗余的4-羟基苯甲酸羟化酶的酶学特性，进一步明确三者的功能，为今后阐明3个4-羟基苯甲酸羟化酶基因的遗传冗余效应提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料与试剂 3
1.2菌株、质粒和引物 4
1.3质粒DNA提取4
1.4 phbh1、phbh2和phbh3基因的功能验证5
1.5 PHBH1、PHBH2和PHBH3的异源表达和纯化5
1.6 SDSPAGE凝胶电泳 5
1.7 PHBH1、PHBH2和PHBH3的酶学差异 6
1.8 4HB结构类似物对PHBH3的竞争性结合抑制 6
1.9化合物检测 6
2结果与分析7
2.1基因phbh1、phbh2和phbh3的功能鉴定7
2.2 PHBH1、PHBH2和PHBH3的表达及纯化7
2.3 PHBH1、PHBH2和PHBH3的酶学特性8
2.3.1 辅因子对PHBH1、PHBH2和PHBH3酶活的影响8
2.3.2 温度对PHBH1、PHBH2和PHBH3酶活的影响9
2.3.3 PH对PHBH1、PHBH2和PHBH3酶活的影响9
2.3.4 PHBH1、PHBH2和PHBH3的底物偏好性9
2.4 4HB结构类似物对PHBH3的酶活影响10 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 

3小结与讨论 11
致谢11
参考文献12
菌株Pigmentiphaga sp. H8中3个4羟基苯甲酸羟化酶的酶学特性比较
引言
溴4羟基苯甲酸（3bromo4hydroxybenzoate, BHB）是一种重要的化工中间体，被广泛应用于农药、医药等化学产品的合成。此外，BHB作为除草剂溴苯腈和溴代芳烃代谢的重要中间产物，而且海洋生物绿藻Ulva lactuca和真菌Bjerkandera sp. BOS55等也可以在环境中自然生物合成BHB[13]，因此其在环境中经常被检出。由于溴原子有很强的吸电子效应，从而增加了分子极性，使BHB更易与生命细胞内的酶系统结合，导致其毒性的增加[4, 5]。因此，BHB对生态环境安全和人类健康有潜在的威胁，其在环境中的命运引起了广泛关注。
微生物是环境中卤代芳烃等有机污染物降解的主力军，微生物编码的酶是卤代芳烃化合物降解和脱毒的关键[6]。然而，学术界关于3卤代4羟基苯甲酸（BHB或者3氯4羟基苯甲酸）的微生物降解研究较少，其降解关键酶基因的挖掘更加匮乏。已报道的3卤代4羟基苯甲酸的微生物降解途径主要有以下4种：1）厌氧微生物Desulfitobacterium chlororespirans通过呼吸型还原脱卤酶以BHB为最终电子受体对其进行还原脱卤生成4羟基苯甲酸，此脱卤过程耦合电子传递磷酸化进而产生能量（ATP）[7]；2）有些厌氧微生物首先通过脱羧酶将BHB转化为2溴苯酚，然后再进行呼吸型还原脱卤反应[8]；3）好氧菌Comamonas sp.7D2中的非呼吸型还原脱卤酶（BhbA和BhbA2）以NADPH作为电子供体对BHB进行还原脱卤反应生成4羟基苯甲酸，与呼吸型还原脱卤不同的是该过程不能产生能量[3, 9]；4）菌株Acinetobacter sp. 4CB1通过水解脱卤酶将BHB转化为4羧基1,2苯醌，随后在双加氧酶的作用下开环降解[10]。总而言之，关于BHB的微生物降解研究不多，其关键降解酶和基因资源极其匮乏。
图1 菌株 Pigmentiphaga sp. H8中BHB和4HB的代谢途径（A和B）及其降解基因簇（C）
Figure 1 Degradation pathways (A and B) and related degradation gene cluster (C) of BHB and 4HB in Pigmentiphaga sp. strain H8
本研究前期从被卤代羟基苯甲酸污染的土壤中分离筛选到一株可以矿化BHB的菌株Pigmentiphaga sp. H8，通过比较转录组学和比较蛋白质组学技术，结合功能基因的异源表达、代谢产物鉴定等实验，揭示了一条新的BHB代谢途径：BHB首先被4羟基苯甲酸羟化酶（PHBH1或PHBH2）转化为溴代原儿茶酸（BrPCA），随后在原儿茶酸3,4双加氧酶（PcaAB或PcaA2B2）的作用下开环降解（图1 A）。其中编码PHBH1或PHBH2的4羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh1和phbh2）是BHB降解的关键起始酶基因，受BHB的诱导表达。有意思的是，在菌株H8的染色体上还存在第3个4羟基苯甲酸羟化酶基因（phbh3），主要负责4羟基苯甲酸的代谢，其编码酶可以将4羟基苯甲酸转化为原儿茶酸（图1 B）。因此，本研究将以菌株H8中3个4羟基苯甲酸羟化酶基因作为研究对象，通过异源表达获取纯酶，并研究其酶学特性，进一步阐明3个4羟基苯甲酸羟化酶的功能，为今后揭示3个4羟基苯甲酸羟化酶基因的遗传冗余效应提供基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
基础盐培养基（Mineral Salts Medium, MSM）：NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 1.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.2±0.2；0.2％酵母粉基础盐培养基（YMS）：基础盐培养基中添加0.2%（w/v）的酵母粉，pH 7.2±0.2；LB培养基（LuriaBertani medium）：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.2±0.2。上述培养基中添加2%的琼脂即可制成相应的固体培养基；PBS缓冲液：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，去离子水1000 mL, pH 7.4。

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