目录
摘要 II
关键词 II
Abstract III
引言
引言 1
1. 材料与方法 4
1.1 实验材料 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 CRISPR/Cas9载体构建 4
1.2.2 水稻遗传转化 7
1.3 转基因材料鉴定 9
1.3.1 提取植物组织DNA 9
1.3.2 突变体鉴定 9
2. 结果与分析 10
2.1 CRISPR/Cas9载体构建 10
2.1.1 设计获得gRNA 10
2.1.2 载体酶切 10
2.1.3 大肠杆菌PCR鉴定 11
2.1.4 农杆菌PCR鉴定 11
2.2 水稻遗传转化 12
2.2.1 诱导愈伤 12
2.2.2 再分化 12
2.3 转基因水稻鉴定 13
3. 讨论 16
致谢 16
参考文献 17
水稻OsFBO1基因敲除材料的构建
摘要
实验室前期工作结果显示水稻OsFBO1基因功能可能与水稻锌稳态相关，为了探究水稻OsFBO1基因的功能，获得相关突变体，本实验利用CRISPR/Cas9技术，依据水稻OsFBO1基因的基因组序列，设计引导引物gRNA，同源重组导入pC1300UbiCas9skm载体，重组质粒经测序鉴定正确后，以农杆菌为介导进行遗传转化至野生型日本晴种子诱导的愈伤组织，培养获得完整植株，转基因植株进行突变鉴定，成功得到30株敲除材料。为进一步研究OsFBO1基因在水稻锌稳态的功能提供了遗传材料，为探究水稻锌稳态调控打下基础。
CONSTRUCTION OF RICE OsFBO1 GENE KNOCKOUT MATERIALS
ABSTRACT
Previous work showed that the function of rice OsFBO1 gene might be related to rice zinc ho *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
meostasis. To explore the rice OsFBO1 gene function, this experiment used CRISPR/Cas9 technology to get the mutants. Based on the genomic sequence of rice OsFBO1 gene, we designed guide primer gRNA, and imported to pC1300UbiCas9skm plasmid by homologous recombination. After recombinant plasmid was checked by sequencing, Agrobacteriummediated genetic was transformed into callus which induced from wildtype Nipponbare seed to get complete plants. Transgenic plants were identified, and 30 knockout plants were successfully obtained, which provided genetic materials for the further study on the function of OsFBO1 gene, and laid a foundation for the exploration of the regulation of rice zinc homeostasis.
KEY WORDS: Rice; Gene editing; OsFBO1; CRISPR/Cas9; Zinc
引言
锌（Zinc, Zn）是植物必需的微量元素，在植物体生长过程中，锌是多种酶的组成成分，在许多过程，如碳水化合物代谢、合成蛋白质、基因表达以及细胞分裂等，发挥重要作用［1］。除此之外，锌可以提高植物的抗逆性，当植物处于旱、涝、盐等不良环境时，植物体内活性氧增加，这会破坏细胞膜透性，导致植物抵抗不良环境的能力降低。锌可以避免蛋白质和膜脂被过氧化，帮助保持细胞膜的完整［2］。
土壤缺锌问题在全球范围内普遍存在，尤其是在亚洲和非洲的大部分地区，作物的产量和营养品质受到影响。缺锌会使植物出现植株矮小、生长缓慢等现象[3]。同时，人体健康与锌密切相关，人体内有100多种酶的活性，如DNA和RNA聚合酶、碱性磷酸酶、碳酸酐酶和超氧化物歧化酶等，和锌有关系。并且锌直接参与蛋白质、核酸等生物大分子的合成、骨骼的发育、能量代谢以及氧化还原等过程。缺锌会导致人体出现生长发育迟缓、免疫力低下、智力障碍，甚至不孕等一系列疾病，因此提高作物中的锌含量至关重要［45］。
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，它作为主食养活了亚洲近一半的人口。在全世界，约50%产谷物地区的土壤有效锌缺乏，由土壤缺锌引起稻米含锌量低，将会导致人体缺锌［67］。除此之外，水稻对微量元素锌较为敏感，轻微增加水稻籽粒中锌的含量，就可以有效改善人体锌营养状况[8]。水稻籽粒中微量元素含量的基因型差异是普遍存在，这有助于我们解决人体缺锌的问题[910]。因此，提高作物的锌利用效率与籽粒中锌的积累可以帮助解决这一全球性问题[1112]。

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