目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料和仪器 2
1.1.1实验材料 2
1.1.2实验试剂及耗材2
1.1.3实验器材2
1.2实验方法2
1.2.1拟南芥种植2
1.2.2过表达载体的构建2
2结果与分析8
2.1过表达载体构建结果8
2.1.1 mettl4基因PCR结果8
2.1.2 pJET1.2载体菌落PCR结果9
2.1.3 pJET1.2载体测序结果9
2.1.4 pJET1.2双酶切结果及V36/V69载体双酶切结果载体构建结果10
2.1.5 V36、V69载体菌落PCR结果11
3讨论 14
致谢14
参考文献15
拟南芥RNA甲基化酶4（Mettl4）的基因克隆
摘 要
RNA甲基化酶针对RNA前体特定碱基增加甲基化标签，介导RNA的成熟、翻译以及降解等多个生物过程。RNA甲基化酶4（Mettl4）是RNA甲基化酶家族重要成员之一，但其具体功能尚未可知。本研究旨在从拟南芥中克隆Mettl4基因并亚克隆进体外表达载体中，以便于后续进行对该基因表达产物的分离纯化以及亚细胞定位研究，进而研究其功能和作用途径。本研究应用异硫氰酸胍有机溶剂法提取了拟南芥总RNA并反转录获得cDNA文库，利用设计的引物克隆得到该酶的cDNA片段并插入扩增载体pJet1.2中，转入大肠杆菌培养扩增后使用酶切连接法与表达载体V36（含YFP标签）以及V69（含StrepII标签）相连接。本次研究所构建载体经过基因测序，验证了体外克隆所得基因序列完全正确。后续研究可以利用融合在Mettl4上的YFP（黄色荧光蛋白）标记来进行产物亚细胞定位，以及利用StrepⅡ标签做产物纯化提取。
引言
中心法则提出，遗传信息经转录和翻译过程产生具有不同功能的蛋白质。然而事实上在基因表达的每一个环节中都有着严密的调控，即使在 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
不改变基因序列的前提下，不同的化学修饰也可以表达出不同的遗传信息。这就是表观遗传学所研究的范畴。即表观遗传学研究的是细胞核酸序列不改变的情况下，由于其他机制而引起的基因功能可逆及可遗传的改变，包含DNA修饰、组蛋白修饰以及RNA修饰等[1][2]。
在过去由于RNA结构复杂、性质不稳定以及缺少先进的分子生物学研究手段，人们一直忽略了RNA在表观遗传学中的重要作用。事实上自然界的大多数RNA都会进行转录后修饰，这些修饰在RNA的结构、功能方面有很重要的作用[3]。现在随着研究技术的发展进步，RNA修饰研究在表观遗传学方面的重要作用越来越为研究人员所重视，最近几年RNA修饰方面的的研究多次登上nature, cell, cancer cell等许多著名杂志，涉及领域从RNA翻译效率到DNA损伤修复，从生长发育到肿瘤形成，其影响力可见一斑。 目前已发现的RNA修饰形式已经超过150种，其中RNA甲基化修饰形式约占60％以上，包括RNA 6甲基腺嘌呤修饰(m6A)[4][5]，RNA5甲基胞嘧啶修饰( m5C)[6]等。这些不同类型的甲基化修饰在细胞的生命活动中发挥着重要的生物学功能[7]，如调控mRNA的剪切、转运和稳定性来参与生物体基因转录后表达调控[8]。
本课题所研究的拟南芥甲基化酶4（Mettl4）是一种能够通过对RNA特定碱基进行甲基化来修饰的蛋白酶，属于RNA甲基化酶家族。本研究旨在体外克隆拟南芥RNA甲基化酶4（Mettl4），并构建体外表达载体，为后续该蛋白的体外纯化，和亚细胞定位研究做前期准备。本次研究拟通过对RNA的反转录获得cDNA文库，利用引物扩增得到该基因片段。使用酶切连接法[9]与V36、V69载体结合，构建表达载体并转入大肠杆菌进行扩繁，完成含有拟南芥甲基化酶4基因的载体构建。其中V36载体携带了YFP（黄色荧光蛋白标签）[10] [11]，后续可以进行产物亚细胞定位研究。V69载体携带了StrepⅡ标签，后续用于产物蛋白纯化。虽然目前RNA修饰的研究依然处于研究的早期阶段。不过，越来越多的证据表明，它们构成了一个新发现的调节基因表达的机制层。可以预测，这一领域研究将对未来的制药业、生物技术、医药和农业产业产生重大影响。
1 材料与方法
1．1 材料和仪器
1．1．1 实验材料
（1）拟南芥（哥伦比亚野生型）
（2）pJET质粒
（3）表达载体V36,V69
1．1．2 实验试剂及耗材
试剂盒
来源公司
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit
南京诺唯赞
FastPure Plasmid Mini Kit
南京诺唯赞
RNA isolater Total RNA Extraction Reagent
南京诺唯赞
PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
TakaRa
CloneJET PCR Cloning Kit
Thermo

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606477.html