： 本研究构建了崇明拟异小杆线虫的新型miRNAs n-miR-9和n-miR-10的过表达载体。利用液氮研磨和Trizol试剂提取崇明拟异小杆线虫的总RNA，用poly (A) 聚合酶加尾后，再进行反转录，得到cDNA。然后从崇明拟异小杆线虫基因组DNA扩增n-miR-9和n-miR-10的前体，克隆到pMD®19-T载体上，经测序鉴定正确后，把其双酶切得到的目的基因再克隆到L4440载体上。重组质粒双酶切鉴定和测序分析结果表明n-miR-9的前体序列成功连接到pMD®19-T载体中。为进一步研究miRNAs n-miR-9 和n-miR-10的调控机制和功能提供了实验基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．2 方法 2
1．2．1 线虫的繁殖与保存 2
1．2．2 Trizol法提取线虫RNA 3
1．2．3 RNA纯度检测 3
1．2．4 反转cDNA 3
1．2．5 miRNA与cDNA的合成 3
1．2．6 目的基因与pMD®19T载体连接 5
1．2．7 感受态细胞的制备 6
1．2．8 连接产物转化 6
1．2．9 PCR鉴定阳性重组质粒 6
1．2．10 重组质粒的提取 6
1．2．11 双酶切鉴定阳性重组质粒 7
1．2．12 DNA测序 7
1．2．13 双酶切产物与L4440载体连接 7
1．2．14 过表达载体的转染 7
2 结果与分析 7
2．1 RNA纯度检测 7
2．2 miRNA扩增 8
2．2．1 nmiR9扩增 8
2．2．2 nmiR10扩增 9
2．3 菌株PCR及提取质粒 9
2．3．1 nmiR9菌株PCR及提取质粒 9
2．3．2 nmiR10菌株PCR及提取质粒 10
2．4 重组质粒
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双酶切和测序比对 10
2．4．1 nmiR9重组质粒双酶切和测序比对 10
2．4．2 nmiR10重组质粒双酶切和测序比对 11
3 讨论 12
致谢 14
参考文献 14
崇明拟异小杆线虫中新型miRNAs nmiR9 和 nmiR10过表达载体的构建

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