目录
摘 要 II
关键词 II
ABSTRACT II
KEY WORDS III
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与试剂 2
1.1.1 植物材料与菌液 2
1.1.1 试剂与仪器 2
1.2 方法步骤 2
1.2.1 制备农杆菌菌液 2
1.2.2 农杆菌真空渗入及VIGS共培养 2
1.2.3 质粒改造玉米Zmubi启动子克隆 3
1.2.4 接种与检测 5
2 结果与分析 7
2.1 不同浸种处理的影响 7
2.2 不同农杆菌菌种的效果 7
2.3 不同真空渗透时间的优化 7
2.4 农杆菌玉米种子共培养时间的优化作用 7
2.5 质粒改造玉米Zmubi启动子克隆及其对玉米TRVVIGS的效应 9
2.5.1 玉米Zmubi启动子克隆鉴定 9
2.5.2 质粒改造玉米Zmubi启动子克隆及其对玉米TRVVIGS的优化 10
2.5.3 pTRV2ubi:ZmPDS载体沉默植株表型鉴定 11
3 讨论 12
致谢 14
参考文献 14
玉米VIGS体系的优化及载体启动子改造对体系的效应
摘 要
病毒诱导的基因沉默（Virusinduced gene silencing, VIGS）可以定向诱导植物
的内源基因发生沉默，引起植株的表型发生变化，进而根据表型变异来研究目标基因的功能。VIGS是近几年发展起来的一种无需获得转基因植株及其后代材料，当代就可以分析、筛选基因功能的高效方法。近年来报道了基于烟草脆裂病毒的玉米VIGS方法，但是玉米VIGS技术体系并不成熟，在常规试验条件下按报道的方法操作，玉米基因的沉默效率低、表现不稳定，难以推广。本研究以玉米八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因为目标基因，针对浸种时间、种子处理方法、农杆菌菌株、真空渗透时间、共培养时间等实验条件因素进行优化，同时将玉米Ubi启动子替换TRV载体中 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072$ 
的35S启动子，以期提高玉米TRVVIGS体系的沉默效率。结果表明：无菌水浸泡种子24h后，用直径为0.4mm的3D打印针刺戳种胚，GV3101农杆菌菌株真空渗透处理60min，共培养10h时，全株出现光漂白症状的植株占出苗植株总数的50%，比优化前的3%的沉默比率提高了约16倍，大幅度提升了沉默效率，为应用于玉米基因功能研究奠定基础。
引言
玉米，属一年生禾本科植物，学名Zea mays L.。玉米是是世界第一大经济作物，是我国主要粮食和饲料作物之一，我国2018年的玉米种植面积达4496.8万公顷[1]。玉米病害一直是影响玉米产量提高和品质改善的限制因素。而在玉米育种的过程中，对于高产优产的过度追求使得玉米品种在趋向单一化，导致玉米对病菌和不良环境抵御能力逐渐降低，所以玉米抗病基因的挖掘和基因功能研究在解决玉米病害方面起到非常重要的作用[2]。
八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是一种植物类胡萝卜素代谢途径中的限速酶，决定植物的花色表现性状。将八氢番茄红素脱氢酶基因沉默后植株会出现漂白的表型症状。因漂白性状具有明显的表型差异，常作为标志性状应用于各种基因研究中。
病毒诱导的基因沉默（Virusinduced gene silencing, VIGS）是近几年快速崛起的可以靶向沉默植物内源基因，导致植物植株的表型发生改变，从而根据表型变异来研究目标基因的功能的新型技术[3]。此项技术当代就可以分析、筛选并鉴定基因的功能，无需获得转基因植株及其后代植株，对于玉米抗病基因的研究有非常重要的意义。研究表明，当插入植物内源基因的片段在200350bp时，VIGS的沉默效率最高，所以VIGS技术不需要目标基因完整的全长基因序列[4]。此外，在植物体表利用VIGS技术对植株进行农杆菌注射之后，该植株23周就可以分析表型变化，无需等待其后代。跟传统的转基因方法相比，有明显的效率优势。目前不仅双子叶植物可以利用VIGS载体，一些单子叶植物和农作物也可以应用：如烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、小麦、玉米等。研究发现大约有37个VIGS载体可以用于双子叶植物基因功能的研究，但应用于单子叶植物的载体十分稀少 [57]。少量文章报道过雀麦花叶病毒[8]（Brome mosaic virus，BMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）[9]、狐尾草花叶病毒[10,11]（Foxtail mosaic virus，FoMV）等多种病毒可以应用于玉米基因沉默，但是以上几种病毒的侵染过程需要外界媒介才能实现，如需要在玉米体外转录合成RNA再进行接种，但体外转录RNA提取成本高，且提取量很小，难以达到想要效果。也可以预接种一些模式作物（如烟草）作为中介植物，通过注射等方式让病毒侵染植株，在其体内转录。待植株发病后，提取植株研磨液，再将转录好的病毒载体接种到玉米体内。但采用中介植物的方法，在接种时通常需要采用摩擦接种[11]的物理方式，具体试验中往往难以控制摩擦程度，而导致试验重复率低：摩擦过度易损伤叶片导致玉米苗畸变，真实结果难以观测；摩擦程度过小，不能成功接种[12]。并且所八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因沉默只能引起玉米叶片的局部白化或者条纹状白化。这些因素阻碍了BMV、CMV、FoMVVIGS体系在玉米中的广泛应用。而具有高白化效率、对寄主植物伤害低的TRV病毒成为玉米病毒载体的优质候选载体。有研究发现利用TRV载体可以沉默PDS基因，并且表现白化现象。Zhang[14]等发现在小麦和玉米的沉默实验中利用TRV载体也可以将PDS基因成功沉默，但是只能引起条纹或者局部白化。有研究通过真空辅助农杆菌渗入及共培养的方法，将TRV病毒侵入玉米植株体内，免去RNA体外转录以及利用媒介植物接种的过程，步骤简单，取得良好的效果，最后可以得到整株白化苗，沉默持续时间长 [14]。然而，怎么做到将TRVVIGS体系大范围地应用于基因功能筛选？怎么获得稳定、持续的优化体系？影响这一体系的外界因素又能从哪些方面入手这些问题是本次研究所要探究的重点。

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