目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS: 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 供试材料 4
1.2 田间种植 4
1.3 水稻基因组DNA的提取（CATB法） 4
1.4 表型鉴定 4
1.5 候选基因分析 5
1.6 连锁不平衡 5
1.7 单倍型分析 5
1.8 载体构建 6
1.9 突变体验证 6
1.10 农艺性状调查 6
1.11 统计分析 7
2 结果与分析 7
2.1 水稻垩白关键位点qPGWC5候选基因分析 7
2.2 水稻垩白关键位点qPGWC5目标候选基因筛选 8
2.3 水稻垩白候选基因OsGRP基因结构分析与突变体构建 9
2.4 水稻突变体OsGRP垩白表型功能验证 9
2.5 水稻突变体OsGRP农艺性状 10
3 讨论 11
参考文献 12
附录 16
致谢 17
水稻垩白关键位点qPGWC5候选基因的功能验证
摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，控制垩白对稻米的品质有重要意义。本研究对课题组前期通过全基因组关联分析检测到的显著关联垩白的关键位点qPGWC5，进一步开展了相关研究，结果发现：垩白关键位点qPGWC5候选区域内有9个显著的SNPs和9个候选基因，富含甘氨酸表达蛋白质候选基因OsGRP与水稻垩白显著关联的SNP连锁最显著，且OsGRP有两种单倍型，HAP2籽粒垩白率显著高于单倍型HAP1。推测，OsGRP可能是目标候选基因，参与水稻胚乳发育的调控。OsGRP编码富含甘氨酸蛋白，内含20个外显子和19个内含子，突变体osgrp的籽粒垩白率显著高于WT，表明OsGRP参与了水稻籽粒垩白性状的调控作用。农艺性状显示突变体osgrp的株高变高，有效穗数下降，表明对水稻的株型也存在影响。本研究对将来深入解析水稻垩白调控OsGRP的调控机理与培育优质水稻品种奠定了基 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
础。
引言
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，我国有60%左右的人口以稻米为主食。随着国民经济的增长，在提高产量的同时兼顾品质和抗性成为我国水稻育种的重要发展方向。稻米产量和品质的形成是个非常复杂的生理过程。胚乳是人们直接食用的部分，占精米的90%以上，胚乳发育直接影响着水稻的产量和品质[1]。
水稻品种品质的一个重要指标就是水稻籽粒垩白率衡量。有研究表明，很多因素影响垩白的形成，其中外界条件的调控和品种的作用对垩白的形成尤其显著[2]。垩白是可以避免的，因为在稻米灌浆的过程中，环境因素是可以控制的，所以推行合理的栽培措施及化学方面的调控，还有不同品种不同地区的规划，这些都能够对稻米的垩白产生影响，减少垩白米粒的出现。在品种培育的问题上，要注重多种与垩白相关联的指标，看它们和垩白性状有何关联，表达量如何，比如合成淀粉酶的指标、分子标记辅助育种等，对这些指标的研究，能够帮助培育出一些少垩白、无垩白的品种，垩白对米质的影响很大，所以目前来说，育种仍然是改良米质垩白性状方法中的重要手段[3]。
垩白是评价稻米外观品质的一个重要指标，稻米胚乳中白色不透明的部分就是垩白，因为胚乳中的淀粉体和蛋白质排列不紧密，造成的一种光学特性[4]。相关文章指明，垩白按照位置不同可以分为心白、腹白、基白、侧白和背白等，其中最为常见的就是心白和腹白[5][6]。表示垩白性状的指标通常有三个，一是垩白粒率，既是在一个样品中，垩白米粒占整个样品的百分率；二是垩白大小，既是米粒中垩白面积占整粒米的投影的百分率，一般将垩白米粒水平放置后测量；三是垩白度，既是在整个样品中有垩白米粒的垩白部分总面积占样品总面积的百分比。垩白是一个对稻米质量十分重要的指标，它不仅影响稻米的加工品质和蒸煮品质，还影响稻米在市场上的商品价值。
全基因组关联分析（Genomewide association study, GWAS）是以连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）为基础的一种研究动植物复杂性状的有效手段，它是基于大量的分子标记来工作的，对研究群体目标性状和分子标记之间关联的关系十分的全面，在研究人类疾病遗传变异和解析植物表型多样性遗传基础上也取得了重大的进展，是近些年刚兴起的一种方法[7]。
关联分析具有很多优势，如基于高密度SNP的关联分析是利用遗传变异较广的自然群体，所以它的定位精度比较高，在单基因水平也达到了较高的成就；其次是关联分析可以大幅度的缩短研究的周期，因为它只需要现有的自然变异群体，而相对于连锁定位来说，连锁定位是基于双亲构建的分离群体，它需要多代的杂交和自交，才能进行分析，比较费时而且费力；另外，自然群体同一基因座上的所有自然等位变异都能被关联分析所扫描到，并且十分的高效，而基于双亲定位群体的连锁分析却只能扫描到每一基因座上的两个等位变异[8][9][10][11]。与传统的连锁定位相比，关联分析具有很多的优势，当然随着分子遗传的发展，越来越多的植物基因组密码被解释出来，这样大的数据库，关联分析就体现出了明显的优势，因为它是建立在以连锁不平衡为基础上的。
当然，关联分析也不是十全十美的，也会有一定的缺点。第一点就是关联分析可能会出现假阳性，导致假阳性的原因往往是由于群体内的部分遗传亲缘关系和群体结构的干扰，因为存在这些影响因素，关联分析就应该选择亚群间等位基因频率相同的群体，这样群体结构相对简单，也能大大的降低假阳性的发生[11][12]；第二点就是关联分析的识别能力不高，对于比较低的频率或者罕见的变异不能够识别，而遗传效应更大的往往就是稀有变异，所以适当扩大研究群体的数量来提高对稀有变异的识别能力，也是十分有必要的[13][14]。
近年来，测序技术更新换代，成本也变得很低，GWAS在植物表型遗传基础的作用上愈变愈大。在水稻的很多重要性状上得到应用。例如，在水稻粒形、抽穗期、株高和分蘖角度等重要的农艺性状上，已经通过GWAS鉴定到多个关键基因。Si等对381份粳稻的粒长和粒重进行表型分析，鉴定到一个新基因OsSPL13控制水稻粒长和产量，并且确定该基因的5’UTR存在一个串联重复序列，从而影响其转录和翻译导致籽粒大小的差异[15]；Yu等对504份栽培稻的粒长进行了表型考察，通过与连锁分析相结合的方法鉴定出一个控制粒长的新基因OsLG3，并发现该基因可以显著提高水稻的产量且不影响稻米品质[16]。Duan等对102份籼稻材料进行了全基因组测序，还考察了102份水稻品种的籽粒大小，定位到一个控制粒宽的主效位点GSE5，并通过进一步的基因敲除和功能互补实验，证实了GSE5在不同材料中的差异表达是造成粒宽表型差异的主要因素[17]。Dong等对529份栽培稻的分蘖角度进行了两年的表型考察，检测到三个主效QTLs，包括前人报道的分蘖角度基因TAC1，并对两个新位点的关键候选基因TAC3和D2进行了后续的功能验证，阐明了分蘖角度在籼粳稻中具有不同遗传调控机制[18]。Yano等通过对176份粳稻材料全基因组重测序，对抽穗期、株高、穗长、穗数、每穗小穗数、叶宽和芒长等农艺性状进行两年的表型鉴定，定位到572个显著的关联位点，验证了四个关键候选基因，包括控制抽穗期基因LOC_Os01g62780，同时控制株高和穗长的基因LOC_Os11g08410，同时控制穗数、小穗数和叶宽的基因LOC_Os04g52479以及控制芒长的基因LOC_Os08g37890[19]。另外，GWAS在水稻胁迫相关性状方面、基于代谢物相关性状、拟南芥、番茄和玉米等植物中的应用中也取得重要进展。

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