目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1供试菌株的保存及培养3
1.1.2培养基4
1.2方法 4
1.2.1稻瘟病菌株DNA、RNA的提取4
1.2.2稻瘟病菌株cDNA的合成4
1.2.3Rgs18片段的获取4
1.2.4通过荧光定量技术(qRTPCR)，验证rgs18在bzip5突变体中的转录水平4
1.2.4.1设计Rgs18定量引物4
1.2.4.2利用qRTPCR，验证Rgs18在MoBzip5突变体中的转录水平5
1.2.5构建BZIP5的表达载体pET32aMoBZIP55
1.2.6大肠杆菌转化pET32aMoBZIP5并验证阳性克隆5
1.2.7诱导MoBzip5的蛋白5
1.2.7.1利用IPTG技术分别在20、25、30摄氏度下诱导蛋白5
1.2.7.2western blot验证6
1.2.8利用EMSA技术研究MoBzip5蛋白和RGS18的启动子是否结6
2结果与分析6
2.1MoRGS18大部分在∆Mobzip5中下调表示6
2.2体外表达载体pET32aMoBZIP5的构建以及大肠杆菌转化7
2.3pET32aMoBZIP5蛋白的获得7
2.4MoBzip5蛋白不能结合RGS18的启动子8
3讨论 8
致谢10
参考文献11
稻瘟病菌转录因子MoBzip5调控G蛋白信号因子Rgs的分子机制初探
摘要
稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的真菌病害，每年造成巨大的粮食产量损失，严重威胁全球的粮食安全。因此稻瘟病菌致病机制的研究有助于稻瘟病的防控。G蛋白偶联受体(Gproteincoupled receptors, GPCR) 是生物体内一类重要的跨膜受体蛋白，通过改变与其偶联的异 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: #351916072# 
三聚体G蛋白(heterotrimeric Gprotein)的构象，进而将胞外信号整合到胞内，激活下游信号途径，从而调控一系列基因的转录，最终引起生物体对外界刺激作出应答。实验室前期研究发现，稻瘟病菌中的8个G蛋白信号调控因子(MoRgs)参与病菌应答胞外疏水信号，调控功能性附着胞的形成，从而调控稻瘟病菌的致病力，然而其调控机制还不清楚。另外，实验室前期研究发现bZIP转录因子MoBzip5调控功能性附着胞的形成，为了研究MoBzip5是否调控Rgs蛋白的转录，从而诱导功能性附着胞的形成。本论文采用qRTPCR方法，发现MoBzip5正调控6个Rgs蛋白的转录。同时，EMAS结果显示MoBizp5无法直接结合8个Rgs蛋白的启动子区，暗示可能存在其他的转录调控因子介导Rgs蛋白的转录。这些结果可望为后期筛选Rgs蛋白的转录因子提供参考。
引言
G蛋白(Guaninenucleotidebinding protein)是与鸟苷酸结合，具有GTP酶水解活性的蛋白。其中异源三聚体G蛋白能够与GPCRs偶联，定位在质膜的内侧，是受鸟苷酸调控的超级家族的信号传导分子，由α、β和γ亚基组成。其中α分子量最大，是异三聚体鸟苷酸的结合位点。当生物体感知到外部信号的刺激，激活G蛋白组件，转导外部信号进入细胞内部，引起基因表达变化，以应答外界胁迫环境。在真菌中，G蛋白在形态建成、生殖、毒力和产生二次代谢产物等过程中具有重要的作用[1]。
异三聚体G蛋白作为一个分子开关在G蛋白偶联受体GPCR介导的信号途径中具有至关重要的作用。在真菌中，异三聚体G蛋白调控了腺苷酸环化酶和磷脂酶活性及离子通道等，从而参与调控营养生长、产孢、侵染结构的分化及致病力等生理过程[2][10]。正常状态下啊，GDP绑定的Gα和Gβ结合，处于Gαβγ非激活状态。当病菌感知寄主表面信号后，激活G蛋白信号途径，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor:GEF)和信号分子结合引起构象改变，形成激活型受体，并与G蛋白的Gα亚基结合，引起Gα亚基构象改变，从而释放GDP，结合GTP，形成激活态的Gα亚基，即由非活化态的GαGDP转变为活化态的GαGTP，引起G蛋白的构象发生改变，促使Gα与Gβγ异二聚体解离。Gα和Gβγ分别作为有活性的信号分子与下游的效应分子结合，将信号传递下去。G蛋白下游的效应分子有多种，包括腺苷酸环化酶、磷脂酶、蛋白激酶Ste20等[2]。将信号传递给下游效应分子后，Gα亚基自身的GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基复合体重新聚合为失活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号，完成一次信号跨膜转换。
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是水稻生产中一类毁灭性真菌病害，造成严重的粮食产量流失。因此研究稻瘟病菌的致病机制对于稻瘟病的防控具有指导价值。真核生物的细胞可对外界的信号刺激做出感知和应答，这对其维持细胞稳态和生长发育具有重要作用。在稻瘟病侵染早期，异三聚体G蛋白(简称G蛋白)信号途径以及下游的cAMPPKA、MAPK等信号传导途径可以通过识别寄主表面信号，从而调控附着胞的形成及其它生物学功能。在外源信号的转换中，G蛋白信号途径及其下游的cAMPPKA和MAPK途径是最重要的信号转换途径之一。
稻瘟病菌识别寄主表面信号后，激活态Gα亚基在自身的GTP酶作用下将GTP水解为GDP，即GαGTP转变为GαGDP，然后与Gβγ二聚体重新聚合成异三聚体，完成信号转换。在此过程中，G蛋白信号调控因子Rgs蛋白作为GTP酶激活蛋白，加速GTP酶水解，通过构象的改变，增强Gα自身的GTP水解速率，同时抑制GDP的释放和Gα亚基与GTP结合过程，来调节G蛋白信号的强弱、持续时间，从而迅速关闭G蛋白信号途径。课题组前期在稻瘟病菌中鉴定到8个Rgs蛋白(MoRgs18)，其中MoRgs58是真菌中新报道的Rgs蛋白[3]。在解析这些MoRgs蛋白功能时发现，这些Rgs蛋白除了包含一个120个氨基酸的RGS结构域外，还含有其他的结构域，其中MoRgs7和MoRgs8的N端含有类似GPCR受体蛋白的7次跨膜结构域，这与拟兰芥的G蛋白调控因子AtRgs1具有相似的结构。我们发现这8个基因分别被敲除后，均导致胞内cAMP含量显著升高，但是突变体的表现型各有差别。MoRGS1、MoRGS2、MoRGS3、MoRGS4、MoRGS6和MoRGS7参与寄主表面识别，在分生孢子的芽管生长和附着胞分化过程中具有重要的作用，这些蛋白编码基因的缺失，导致分生孢子萌发形成的芽管顶端产生2个附着胞。进一步发现MoRGS1负调控Gα亚基MagA，控制胞内cAMP浓度，参与表面识别，其编码基因缺失后，突变体可在非诱导型的亲水界面上形成附着胞[11]。此外，无性产孢、有性生殖、菌丝的疏水性由MoRGS1调控而MoRGS4调控细胞壁的完整性；有信生殖与MoRGS1负调控Gα亚基MagB有关；MoRGS2作用于MagB上游，调控无性产孢；MoRGS1、MoRGS3、MoRGS4和MoRGS7均参与致病过程。尽管上述信号途径在多种植物病原真菌中已经阐明，但是G蛋白信号如何被准确调控进而发挥其感知表面信号的功能，目前仍不清楚。

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