目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 菌株和质粒 5
1.1.2 实验中使用的抗生素 5
1.1.3 引物和酶 5
1.1.4 培养基 5
1.1.5 主要试剂 6
1.2 方法 6
1.2.1 菌株培养条件和保存方法 6
1.2.2 聚合酶链式反应 6
1.2.2.1 引物设计 7
1.2.2.2 模板制备 7
1.2.2.3 PCR反应体系 7
1.2.2.4 PCR反应相关条件 7
1.2.2.5 PCR扩增产物的检测 7
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 8
1.2.4 感受态细胞的制备 8
1.2.5 转化 8
1.2.5.1 电脉冲转化 8
1.2.5.2 热激转化 9
1.2.6 质粒的提取 9
1.2.7 三亲接合 9
2 结果与分析 10
2.1 效应物转运报告系统相关载体构建 10
2.1.1 效应物转运报告系统构建技术路线 10
2.1.2 效应物转运报告系统构建 11
2.2 GUS融合相关载体构建 12
2.2.1 GUS融合构建技术路线 12
2.2.2 GUS融合构建 13
3 讨论和结论 14
3.1 转运报告系统 14
3.2 GUS融合鉴定系统 14
致谢 14
参考文献 15水稻白叶枯病菌PXO99A中XopAE3鉴定相关载体的构建
摘要
水稻白叶枯病（the bacterial blight of rice）是导致水稻减产的重要病害，病原物是黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）。Xoo致病力与其产生的效应物有 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
关，效应物依赖III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）注入植物寄主细胞中，帮助病原菌在寄主中生长繁殖。T3SS是蛋白组成的类似注射器的蛋白复合体，如hrcV的缺失会使T3SS失效；同时效应物的转运受到如hrpG和hrpX的调节。在水稻白叶枯病菌PXO99A中，生物信息学分析发现两个类似XopAE结构，对其中一个命名为XopAE3研究，发现XopAE3的启动子区域具有非典型的PIPbox（imperfect plantinducible promoter，非典型PIPbox）。本研究的目的是构建相关的载体和菌株，为实验验证非典型的PIPbox是否可以发挥PIPbox的功能，以及XopAE3是否是潜在的nonTAL效应物（non transcription activatorlike effectors，nonTAL效应物）做铺垫。本实验构建了效应物转运报告系统相关载体菌株，将XopAE3和avrBs159445重组质粒pJAGXopAE3导入了十字花科黑腐病菌8004ΔavrBs1和8004ΔhrcV菌株中；GUS融合鉴定非典型PIPbox系统中，重组质粒导入了8004、8004ΔhrpG和8004ΔhrpX菌株。
引言
水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）是一种能够在全球范围内引起水稻白叶枯病（the bacterial blight of rice）的重要病原细菌，属于一种革兰氏阴性菌[1]。水稻白叶枯病最早于1884年在日本福冈地区被发现；由于病原菌从植物寄主的排水组织、气孔、伤口侵入植物后，会造成水稻叶片发白枯萎，多年来已经逐渐成为威胁我国水稻产量的主要病害之一[1,2]。在水稻白叶枯病菌致病机制研究中，日本菌株MAFF311018、韩国菌株、菲律宾菌株PXO99A都是完成了全基因组测序的模式菌株[35]）。其中PXO99A菌株是分离于菲律宾Xoo的6号小种（PXO99）的5氮杂胞嘧啶核苷抗性突变体[6]。其与MAFF311018和KACC10311菌株相比，具有更为广泛的寄主范围，在多种具有遗传抗性的水稻品种中表现出毒性作用，因其相对广泛的品种特异性，PXO99A一直是研究细菌白叶枯病害的优选对象[7]。
植物可以通过识别微生物的分子特征来感知病原体，这些特征被称为病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）[8]。植物最初感知病原物涉及到细胞表面受体的识别[9]；随后，通过蛋白激酶复合物的信号级联，激活防御基因的表达，导致植物防御反应的产生[10]。这些有助于植物对抗多种病原体的反应被称为PAMP触发的免疫反应（PAMPtriggered immunity, PTI）。为了对抗植物防御反应，许多革兰氏阴性病原菌使用III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）分泌的效应物来抑制PTI，帮助病原物在植物中的生长繁殖[11]。反过来，植物又进化出抗性或“R”基因，这些基因识别效应物或效应物作用后的产物，从而触发植物的另一层免疫反应，称为效应物触发的免疫反应（effectortriggered immunity，ETI）。同时，病原菌T3SS分泌的一些效应物能够抑制植物ETI[12]。
III型分泌系统是大多数病原菌共同拥有的效应物（effectors）分泌系统，在病原微生物中，编码它的基因序列高度保守[13,14]。T3SS整个系统就像是病原菌自身的一种注射器装置，能够在病原菌侵染植物寄主时，将一些毒力因子、辅助因子等注入植物细胞，帮助病原菌的侵入。它是由大量的hrp基因（hypersensitive reaction and pathogencity gene，hrp）编码的蛋白组装形成。Hrp基因与病原菌在寄主上的致病性相关，同时在非寄主植物上，hrp基因的存在会诱导植物细胞快速死亡以对抗病原菌，称为植物过敏反应（hypersensitive response，HR）[15]。在这些hrp基因中，有9个基因在大部分病原菌中高度保守，被称为hrc（hypersensitive response and conserved）基因；它们都编码T3SS的核心构件，比如hrpV编码的蛋白就结合在病原菌内、外膜之间，参与形成效应物的分泌通道[16]。除此之外，在一些病原菌的hrp基因调控模式中，有部分的hrp基因扮演着相当关键的角色，比如十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc）中，双组分系统调控蛋白HrpG和转录激活蛋白HrpX就参与致病机制中的基因调控；它们的存在，对hrp基因簇和效应物基因表达相当重要[17]。这些发现，对于效应物的鉴定系统的构建提供了方法基础。

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