目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 2
Key words 2
引言 3
1 材料和方法 5
1.1 实验材料和试剂 5
1.1.1 菌株和载体 5
1.1.2 主要试剂 6
1.1.3 培养基的配制 6
1.2 引物的设计 6
1.3 原核表达载体构建 6
1.3.1 质粒提取 6
1.3.2 PCR扩增 7
1.3.3 载体酶切 7
1.3.4 胶回收 8
1.3.5 同源重组 8
1.3.6 重组产物转化 9
1.3.7 菌落PCR 9
1.4 诱导重组蛋白表达及蛋白电泳 9
2 结果与分析 10
2.1 PCR扩增 10
2.2 载体酶切 10
2.3 菌落PCR 11
2.4 诱导重组蛋白表达 12
3 讨论与结论 12
3.1 载体构建常用方法 12
3.1.1 传统的酶切连接法 12
3.1.2 一步克隆法 13
3.1.3 Gateway技术 13
3.2 原核表达过程中的影响因素 13
3.2.1 表达载体 13
3.2.2 宿主菌株 14
3.2.3 诱导条件 14
3.3 PIP5K基因功能分析 14
致谢 14
参考文献 15
拟南芥磷脂酰肌醇磷酸激酶AtPIP5K1基因
在大肠杆菌中的蛋白诱导表达
摘要
磷脂酰肌醇磷酸激酶（Phosphatidylinositol 4Phosphate 5Kinase， PIP5K）是磷脂酰肌醇信号转导途径的关键酶，在植物、动物以及酵母中都有着广泛的分布，其生物学功能通过其产物得以实现。PIP5K同工酶众多，拟南芥AtPIP5K1是第一个已知的植物PIP5K蛋白。AtPIP5K1在植物在生长发育、对逆境胁迫的反应和植物抗 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
病反应中有着不可或缺的作用。为进一步探究AtPIP5K1生物学功能和理解磷脂酰肌醇信号转导途径在植物抗病反应中的基本机制，我们通过PCR扩增、载体酶切、连接转化等步骤，将AtPIP5K1基因克隆于pET32a原核表达载体上并转化至大肠杆菌中后诱导表达重组目的蛋白。在18 ℃，0.1 mmol/L IPTG的条件下180 rpm震荡培养14 h诱导蛋白表达，经SDSPAGE电泳检测出现一条约为100 kDa 的较高浓度蛋白条带。本实验成功构建AtPIP5K1原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到表达，为探究AtPIP5K1蛋白提供依据。
引言
由脂质和蛋白质作为主要成分的生物膜是划分和分隔细胞和细胞器的重要物质，磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol, PI）则是生物膜的重要组成部分，也是细胞对外界信号刺激做出应答的物质基础， PI信号转导途径在植物的种子萌发、生长发育等一系列生理过程中起着不可或缺的作用。磷脂酰肌醇磷酸激酶（Phosphatidylinositol 4Phosphate 5Kinase, PIP5K）能够催化PI4磷酸（PI4P）磷酸化来 合成一种磷脂分子PI4,5二磷酸[PI(4,5)P2]，此过程是PI信号转导途径的重要内容，因此PIP5K在磷脂酰肌醇信号转导途径具有关键酶作用[1]。
PIP5K是一类重要的信号分子合成酶，在植物、动物以及酵母中都有着广泛的分布。PIP5K是生物体内的磷脂类激酶，所能利用的底物非常广泛，其生物学功能也是借助它们的产物，如PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3等来实现的。作为PI信号转导途径的关键酶，PIP5K借助调控PI信号转导途径进而起到调节多种植物细胞功能的作用。
PIP5K有着多种分子结构不同但功能相同的酶，即同工酶，由一个基因家族编码，其中拟南芥PIP5K基因家族共有11个成员，AtPIP5K1是第一个已知的植物PIP5K蛋白；水稻基因组中，具有8个PIP5K基因[2]。拟南芥基因组包含编码11种PIP5Ks蛋白亚型的基因，分为两个不同的亚家族：A型包括PIP5K10和PIP5K11，结构域结构类似于哺乳动物和酵母中的PIP5K；而B型包括PIP5K1PIP5K9异构体，带有额外的N端LIN和Morn结构域。大多数AtPIP5Ks和OsPIP5Ks的N端具有多MORN（Membrane Occupation and Recognition Nexus，即膜识别与结合序列）结构域，研究发现这一结构域是PIP5K独有的结构域，C端的一个PIPKc结构域具有催化功能。MORN结构域的特点是序列较短、重复次数多、序列保守，且各个“MORN”结构域之间几乎全以Gly（甘氨酸）相连接[3]。有文章指出，某些特定的激活剂激活PIP5K同工酶后，PIP5K能够在某些特定的细胞功能中起到重要作用[4]。PIP5K不同成员之间由于存在磷脂激酶同源域（lipid kinase domains, LKDs）的激酶核心区域而拥有一定的同源性，但此核心区域外同源性较差。因此，PIP5K在植物中的功能既有相似也有不同。
PIP5Ks在调节植物开花及根的生长发育、植物对逆境胁迫应答等过程中起到重要作用。水稻主枝和分蘖枝决定了水稻的株型结构，其发育的变化进而对最终产量产生重大影响。研究证明水稻中OsPIP5K1与DWARF TILLER1 （DWT1）相互作用调节水稻主茎和分蘖的均匀生长[5]。OsPIP5K1参与水稻幼苗的生长发育，且负调控水稻开花过程[3]，主要表现在其反义转基因植物幼苗生长状态明显较同一时期的野生型幼苗弱且开花时间较野生型早。PIP5K可以磷酸化PI4P产生PI(4,5)P2，PI(4,5)P2在磷脂酶C（phospholipase C，PLC）的催化下产生肌醇1,4,5三磷酸（inositol 1, 4, 5triphosphate，IP3）和甘油二脂（diacylglycerol，DAG）。IP3能促进细胞内Ca2+的释放，引发气孔的关闭以促使植物响应干旱胁迫，同时避免水分胁迫对活性氧（ROS）的平衡干扰带来的氧化胁迫，此过程表明AtPIP5K1参与水胁迫信号转导[6]。研究发现AtPIP5K1在花、叶和根的维管组织中表达较为强烈，即在原形成层的细胞中表达最强，表明AtPIP5K1在细胞增殖的调控过程中可能发挥着重要作用[7]。AtPIP5K2基因和AtPIP5K3基因分别参与调节拟南芥适应盐胁迫和根毛顶端的生长[89]。AtPIP5K46参与花粉管的生长，其中AtPIP5K4还参与调节拟南芥气孔的开关，AtPIP5K9通过负调控拟南芥根细胞中的细胞质碱性/中性转化酶(AtCINV1)的活性达到抑制根的生长的功能[10]。AtPIP5K1和AtPIP5K2在拟南芥花粉发育过程中，均参与调节液泡的蛋白质运输和液泡形态发生进程，且AtPIP5K1参与合成的PI(4,5)P2是花粉合成初期的关键物质。AtPIP5K在拟南芥营养生长发育过程中表现出部分冗余和加性作用，其中AtPIP5K1和AtPIP5K2起到主要作用。

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