目录
摘要 4
关键词 4
ABSTRACT 4
KEY WORDS 4
引言 4
研究内容 6
1 材料与方法： 6
1.1大豆疫霉GH3基因家族和蛋白的鉴定分析 6
1.1.1 大豆GH3外泌蛋白的功能分析 6
1.1.2 卵菌中的GH3家族基因的系统进化分析 6
1.2实验材料 7
1.2.1 供试菌株及保存 7
1.2.2 供试植物 7
1.2.3 主要生化试剂盒 7
1.2.4 主要仪器 7
1.3 培养基的制备 7
1.3.1 LB培养基的制备 7
1.3.2 抗生素类培养基的制备 7
1.4 质粒载体 7
1.5 核酸操作 8
1.5.1 基因扩增 8
1.5.2 DNA扩增片段的产物纯化 8
1.5.3 质粒DNA的提取 9
1.6 载体构建 10
1.7 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化 11
1.7.1 用Inoue法制备大肠杆菌JM109感受态细胞 11
1.6.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的转化 11
1.8 农杆菌GV3101电击感受态细胞的制备与转化 12
1.8.1 农杆菌GV3101电击感受态细胞的制备 12
1.8.2 农杆菌GV3101电击感受态细胞的转化 13
1.9 农杆菌介导的瞬时表达 13
2 结果与分析： 15
2.1大豆疫霉中GH3基因家族的基因序列和蛋白序列的结构预测 15
2.2 GH3家族基因在大豆疫霉不同侵染阶段的表达量分析 16
2.3 GH3糖基水解酶家族蛋白序列在不同疫霉中的序列对比和进化树分析 18
2.4 烟草瞬时表达载体的构建结果 19
2.4.1 大肠杆菌转化的菌落PCR验证 19
2.4.2 农杆菌电击转化的菌落PCR验证 19
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.5 Ps131903的功能初步验证 20
讨论 20
参考文献 22
大豆疫霉GH3基因家族功能分析与初步研究
摘要
Glyco_hydro_3类基因家族（简称GH3基因家族）是大豆疫霉等卵菌及多种真菌、细菌在内的一类重要基因家族。该家族编码糖基水解酶，主要作用于各种糖苷键水解多糖分子。病原菌基因组编码大量GH3家族水解酶，对病原物侵染寄主起着重要作用。本次实验对大豆疫霉中分离提取的五种胞外糖基水解酶进行生物信息学分析。利用NCBI和SMART网站，MEGA 7 、SeqHunter 软件等分析其基因序列和氨基酸序列，发现其拥有β葡萄糖苷酶、糖基水解酶、糖苷水解酶的保守结构域。随后克隆了大豆疫霉的Ps131903基因，并利用农杆菌介导的瞬时表达系统，在烟草上瞬时表达该蛋白，发现其能诱导烟草的细胞坏死。这些研究结果暗示了Ps131903水解酶被疫霉菌分泌至植物质外体，被植物识别诱导细胞坏死。对大豆疫霉GH3基因家族的分析有助于揭示疫霉菌与植物互作的分子基础。
引言
大豆疫霉菌（phytophthora sojae）的寄主范围狭窄，只侵染大豆等豆科植物，在大豆整个生育期造成危害，在出苗前可以引起种子腐烂、出苗前腐烂，出苗后可以引起植株枯萎，其引起的大豆茎腐和根腐病害是造成我国大豆产量低的主要原因之一。一般发病田块能减产30%以上，严重时甚至会导致整块田地颗粒无收。而且该病害在全球范围内广泛存在，不仅在中国为害严重，在美国、加拿大、巴西、印度等南北美、非洲甚至包括欧洲和大洋洲的各大大豆主要产地都有发生且造成巨大的经济损失。
植物生活在自然界中面临着多种多样病原菌的入侵，在植物与病原菌互作的过程中进化出了一套复杂的先天免疫系统来识别并抵御病原菌，植物在应对病原物入侵时启动相应的防卫反应。植物先天免疫系统包括两个方面[1][2]，一方面是植物细胞表面的模式识别受体(PRRs)识别病原相关模式分子(PAMPs或MAMPs)[3][4]，从而识别各类微生物，诱导植物产生免疫反应(PAMPtriggered immunityPTI)，植物病原微生物产生的激发子以及PAMPs和MAMPs是重要的信号分子，在植物与寄主互作过程中启动不同的信号途径，引发植物的广谱抗性。另一方面是植物通过抗性蛋白(R蛋白)识别病原菌分泌的效应分子(无毒蛋白，avr)[5]引发的免疫反应(Effectortriggered immunityETI)[1]。目前，国内外针对大豆疫霉菌侵染大豆过程中大豆植物对大豆疫霉产生的PTI和ETI免疫反应都已进行了大量的研究，因此，此次试验设计我们选择大豆疫霉菌作为研究对象，对大豆疫霉在侵染过程中分泌的糖基水解酶在其与植物互作中的功能进行初步的研究。
包括细菌、真菌、卵菌在内的几乎所有种类的植物病原物在侵染寄主植物时都必须经过接触、侵入、潜育、发病四个阶段[6]，其中病原物能否与寄主植物建立寄生关系，即接触后能否成功侵染、侵染后能否成功定殖，以及建立寄生关系后病原物与寄主的竞争情况，即病原物躲避植物免疫反应、完成营养掠夺和自身增殖扩散的情况，是决定植物是否发病以及发病程度的两个至关重要的因素。而无论是在建立寄生关系的过程中，还是在病原物进行养分掠夺和增殖扩散的过程中，病原物都必须要与寄主植物进行激烈的“攻防战”，并且必须要突破寄主植物体内的重重防线，才能成功侵染植物。植物细胞壁是植物体中的一种重要防御结构，由纤维素、半纤维素、多聚糖和果胶等细胞多糖物质[7]组成。细胞壁是植物体对抗病原物入侵的第一道防线。因此，在漫长的病原物植物“攻防战”历史中，病原菌也进化出了对应的入侵方式——分泌多种碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzymes, CAZymes)[3]即多种胞外糖基水解酶。植物病原菌分泌的多种碳水化合物活性酶参与寄主植物细胞壁的降解作用，这些酶对植物细胞壁的降解有利于病原菌附着、侵入、定殖寄主植株以及营养吸收等过程[8]。研究表明，这些胞外糖基水解酶属于GHs家族，致病菌在侵染寄主植物的过程中会分泌多种GHs酶类，这类酶可以将植物多糖分解成寡糖或者单糖，破坏细胞壁结构以突破表皮障碍，同时实现自身繁殖所需的营养物质的吸收利用[9]。部分GH家族基因在侵染过程中参与了降解植物细胞壁的过程，主要包括26个亚家族，GH1、GH3、GH28、GH45、GH51、GH61、 GH105等[10]。因此，植物病原菌胞外分泌蛋白中的碳水化合物活性酶，尤其是植物细胞壁降解酶类对病原菌的侵染能力和营养特性来说是必不可少的。[8]

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