目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言1
1材料与方法4
1.1实验材料与设备4
1.1.1实验材料4
1.1.2实验设备4
1.2实验方法4
1.2.1水稻植株的培育4
1.2.2接种纹枯病菌4
1.2.3取样5
1.2.4激光显微切割5
1.2.5切割样品中纹枯病菌所占比例验证5
1.2.6靶基因验证5
2结果与分析5
2.1激光显微切割能精准地富集水稻体内菌丝5
2.2靶基因验证6
3讨论和结论8
致谢9
参考文献9
基于激光显微切割技术对水稻纹枯病菌致病因子的研究
摘要
激光显微切割技术具有精度高、速度快、污染少、操作简单等优点。大量文献资料显示，激光显微切割在植物学领域的研究中广泛应用，且效果较好。本文主要介绍了水稻纹枯病菌致病因子方面的研究成果以及激光显微切割技术在此领域的主要作用与特点。在本次实验中，经过激光显微切割处理的水稻茎秆内部的水稻纹枯病菌与组织完全分离，提取RNA，通过RTPCR与凝胶电泳测定水稻纹枯病菌与水稻组织的含量之比；在随后的结果验证中，以漆酶前体蛋白编码基因OsLAC5为靶基因，通过水稻中发现的小RNA对其进行干扰，观察受侵染组中靶基因转录情况，并与空白对照组进行对比。结果显示水稻纹枯病菌含量远高于杂质，且靶基因OsLAC5验证正常，表明以上研究结果为后续深入解析纹枯病菌小RNA在侵染水稻过程的功能及作用机制奠定了良好基础。本次研究结果证明激光显微切割技术适用于水稻纹枯病菌的研究，在未来将成为此领域的重要研究手段。
引言
作为世界三大水稻病害之一，水稻纹枯病一直以来都是水稻生产中的主要障碍之一，因此也是水稻病害防治的重中之重。目前，许多水稻纹枯病方面的研究主要针对其病原物，立枯丝核菌侵染中所产生的致病因子，毒素与细胞壁降解酶。由于此类物质多为微小的物质，传统的观测与分析法效果普遍不佳。
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症状为叶鞘有暗绿色水渍状病斑，后期逐渐扩大为中心灰色、边缘深褐色的椭圆形病斑，严重时多个病斑融合形成云纹状病斑，叶片枯死，穗期发病可导致水稻无法抽穗。水稻纹枯病多发生在高温、高湿的环境下，苗期至穗期均可发病。
水稻纹枯病菌的致病因子主要分为毒素与细胞壁降解酶。毒素的主要作用是侵入植物细胞，干扰细胞蛋白合成、代谢或呼吸等生理活动，使细胞物质外渗。细胞壁降解酶的主要作用是破坏细胞壁，降解纤维素、果胶等物质，使病菌便于侵染细胞。
当下对水稻纹枯病菌致病因子的研究的主要流程大致分为三个步骤，即分离提取病原物、分析结构与成分、测定主要功能[12]。其中，后两个步骤可采用的技术较为全面、可靠，能准确无误地完成目的；但在分离病组织方面，由于水稻纹枯病的发病部位大都含有杂质，能否去除杂质对实验结果的准确度存在一定的影响。然而，目前此方面的研究主要还是通过一些传统方法进行分离，例如将水稻病斑部位剪下、碾碎、过滤[34]，此类方法虽然成本较低，但所得产物大都为含有大量杂质的混合物，从中提取、分离出纯净的物质十分困难，且效果往往无法满足实验需求。
激光显微切割技术是近年来新兴的一项技术，最初主要用于临床医学[6]、动物科学[7]等方面的研究，现阶段也逐渐开始用于植物学领域的研究。其特点主要包括速度快、无污染、操作简单、精确度高[8]。
激光显微切割技术的主要原理是：在显微镜下用激光器发射微型激光脉冲，切割特定部位组织与细胞，并使其与附着的聚乙烯热塑膜进入收集装置。常见激光显微切割的流程包括三步：制备样品、显微切割、分离产物。其中，制备样品这一步最为重要，可分为固定、包埋、切片、染色四步。
当下植物生物学实验中主要使用的激光显微切割技术主要有两类，激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)与激光辅助显微切割(Laserassisted Microdissection，LAM)。其中，激光捕获显微切割可分为激光消融切除(Laser Ablation Excision，LAE) 与激光压力弹射(Laser Microdissection and Pressure Catapulting，LMPC)。以激光捕获显微切割为例，研究人员通过该技术，可在显微镜下精确、高效获取某一组织、单一细胞亚群，甚至单一细胞。在植物学实验中，激光捕获显微切割常用于分离特定部位细胞，以提取RNA或转录物，构建cDNA文库[1011]。此外，激光显微切割也可被用于蛋白质组的研究[12]。
本次研究主要目的是探究激光显微切割技术在水稻纹枯病菌致病因子的研究中可发挥的实际作用。水稻纹枯病菌的研究需要高精度、高效率的分离技术，而激光显微切割符合这一标准，因而在理论上是此领域的理想研究手段。本次研究的意义在于，实验结果会展示此项技术的优缺点，为此领域未来的研究提供一定的参考信息。
水稻纹枯病菌致病因子方面的研究目前主要集中于对致病物质的分析，对此方面实验技术的总结文献较少。

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