类受体激酶（RLKs）作为免疫信号下游通路中的传导元件在激活病原相关模式分子诱导的免疫反应中发挥重要作用。为进一步研究候选模式分子诱导免疫的下游信号传递通路，本项目选取了一些候选LRR-RLKs，采用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）技术，构建了10个TRV沉默载体，并通过农杆菌注射的方法，沉默相应的RLK蛋白。通过观察沉默烟草中ROS的迸发及XEG1等蛋白在沉默烟草中的细胞坏死，初步筛选出参与候选病原相关模式分子诱导免疫的RLKs基因并进行初步的功能分析。研究结果将有助于进一步揭示植物的先天免疫信号传递机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1实验材料2
2 TRV沉默载体的构建2
2.1 PCR反应引物的设计2
2.2聚合酶链式反应2
2.2.1 PCR反应体系2
2.2.2 PCR扩增条件2
2.3 DNA凝胶电泳的检测3
2.3.1琼脂糖凝胶的制备3
2.3.2电泳分离3
2.3.3凝胶回收纯化 3
2.4酶切载体的制备3
2.4.1单酶切载体3
2.4.2酶切产物回收纯化3
2.5连接转化4
2.5.1连接 4
2.5.2热击法转化大肠杆菌4
2.6菌落PCR验证 4
2.7质粒的提取 5
3 本氏烟接种实验5
3.1电击法转化农杆菌5
3.2农杆菌介导的基因沉默5
3.3基因的转录分析6
3.3.1总RNA的提取6
3.2.2 RNA逆转录反应7
3.2.3 qRTPCR7
3.4活性氧的检测7
3.5 PsXEG1、INF1、NPP1、Avr3a的瞬时表达8
4 实验结果与分析8
4.1 TRV沉默载体的构建8
4.2候选RLK基因沉默效率的检测9
4.3沉默候选RLK基因烟草中flg22诱导的活性氧迸发9
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论11
致谢11
参考文献12
初步解析受体蛋白激酶在模式分子免疫信号传递中的功能
引言
植物的先天免疫系统包括两个不同的层面：病原相关模式分子（PathogenAssociated Molecular Patterns，PAMPs）诱导的PTI（全称）反应和效应分子诱导的ETI（全称）反应。病原菌的一些保守的病原相关模式分子（PAMPs）能够被植物表面的模式识别受体（全称，PRRs）所识别，激活植物的PTI反应。病原菌为了阻断植物的PTI反应，会释放一系列的效应分子通过结合免疫受体或下游通路中的组分去干扰免疫途径。为了抵御病原菌侵染，植物又会相应地进化出抗性蛋白（R蛋白）识别病原菌的效应分子激活ETI反应[12]。病原菌与植物的互作能诱发植物产生活性氧（ROS）的迸发、过敏性细胞死亡(HR)等防御反应[34]。植物和病原菌的战斗从未停止，在互作中共同进化[1]。病原相关模式分子PAMPs在微生物中广泛存在，具有保守的分子结构特征。PAMPs不仅在植物与微生物互作的过程中发挥着重要作用，还是一种对微生物自身的生长发育和适应外在环境的必要物质。PAMPs能够诱发免疫反应，同时一些PAMPs具有的毒性功能也能帮助病原菌侵染植物。因此，病原菌要成功侵染植物必须突破PTI防线[2,5]。PTI反应表现为广谱性，能够提高非寄主抗性，对培育植物抗性品种具有重要意义。
植物免疫信号的传导依赖于信号传导元件，植物细胞膜表面的模式识别受体(PRR)识别病原物后产生免疫信号，通过植物细胞内复杂的信号传递网络传递至胞内，激活免疫反应[6]。植物的类受体激酶(ReceptorLike Protein Kinase, RLKs)能够识别PAMPs并作为免疫信号传导元件激活下游免疫信号[7]。目前，已鉴定到的病原相关模式分子XEG1、INF1等能够被植物识别而引发过敏性坏死反应，并触发一系列的免疫反应[810]。XEG1的模式识别受体为RXEG1，属于富含亮氨酸重复序列（LRR）的类受体蛋白(ReceptorLike Proteins, RLPs)[11]。属富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（LRRRLKs）的BAK1和SOBIR1能够作为RXEG1的共受体参与XEG1诱导的下游信号的激活，从而激活相应的免疫反应[1112]。此外，INF1诱导烟草细胞过敏性坏死的能力也依赖于共受体BAK1和SOBIR1[9]。flg22的模式识别受体为FLS2，能够与BAK1形成复合物，一同识别flg22并激活下游信号途径，触发植物免疫反应[13]。
LRRRLKs在功能上不仅参与了植物的防卫反应，对植物的生长发育也起到协调作用，对植物具有广泛而重要的意义[7]。目前对于大多数LRRRLKs的功能、信号传递方面的了解甚少，且目前对于大多数PAMPs诱导免疫的下游信号激活的作用机理尚不清楚，因此鉴定模式分子识别受体下游参与免疫信号传递的作用元件LRRRLKs，并进行功能的初步分析，可为全面认识免疫信号传递网络提供一定依据。
1 实验材料
实验所用到的大肠杆菌菌株为JM109，农杆菌菌株为GV3101，均为实验室保存。将菌株摇菌于相应抗性的LB培养基后，用50％甘油冷冻保存于70℃冰箱中。
实验所使用到的植物材料本氏烟种子为实验室保存，培养条件为：25℃光照，20℃黑暗。光照时长16h，黑暗时长8h。待本氏烟生长23周后用于烟草沉默实验，待本氏烟生长68周后用于农杆菌介导的瞬时转化实验。
2 沉默载体的构建

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/607349.html