目录
摘 要 II
关键词 II
ABSTRACT III
KEY WORDS III
引言 4
1．材料与方法 6
1．1供试菌株与抗生素 6
1．2仪器设备与程序设置 7
1．3实验步骤 7
1．3．1 NA培养基中不同浓度PXO99菌悬液的配制及加样 7
1．3．2无菌水中不同浓度PXO99菌悬液的配制及加样 7
1．3．3检测荧光强度 7
2．结果与分析 7
2．1酶标仪荧光强度检测结果 7
2．2 结果分析 8
2．2．1荧光强度与菌液浓度之间关系 8
2．2．2荧光强度与菌含量之间关系 9
3．讨论 10
致 谢 11
参考文献: 12
以荧光强度表征PXO99菌含量的方法体系的构建
摘 要
微生物学科研究大多需要对菌含量进行准确检测，传统的微生物计数方法有平板计数法和显微计数法，这些方法虽简单准确，但是操作繁琐且费时费力。构建一种省时简便且能够直观准确的表征微生物含量的方法，可以加快实验进程，优化实验方案。
本实验利用荧光蛋白标记的相关技术，以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因作为报告基因，以水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）PXO99菌株为供试菌株，研究标记菌株的荧光强度与其菌含量之间的数字关系。经过重复实验得知，GFP标记的PXO99菌悬液浓度和荧光强度存在线性相关，联合平板计数法得到的菌含量确定荧光强度与活菌数量之间的线性回归方程，在NA培养基中：y = 723.49 x + 2223.9（R² = 0.9949）；在无菌水中：y = 407.06 x + 1963.9（R² = 0.99）。
本研究明确了标记菌株荧光强度与活菌数量之间存在线性关系，并联合平板计数法得到荧光强度与活菌数量之间的标准曲线拟合方程，可利用测定的荧光强度数值预估出标记菌株的菌含量，得以构建一种以GFP荧光强度推 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
测标记PXO99菌株菌含量的表征方法体系。
引言
在微生物相关实验研究或实际生产中，经常需要测定微生物含量，目前检测菌含量的标准方法是平板计数法，该方法虽原理简单、结果准确，但是具有操作繁琐、实验周期较长、批量操作时耗时耗力等缺点。还有一种常见的计数方法是显微计数法，所需时间相对较短、操作简单，但误差较大，对检测人员操作技能有一定的要求。并且，平板计数法和显微计数法既无法区分“可生存但不可培养”(viable but nonculturable，VBNC)状态下细胞，也无法对复杂菌系中的单一菌种进行有效定量[1]，适用范围较小。为满足实验或生产当中批量测定菌落含量的需求，构建一种简便快捷、灵敏度高、特异性强的菌含量检测方法极为重要。
传统方法的种种局限性成为了研究学者们不断探索新型微生物计数方法的动力。随着各个学科的不断发展，新型的微生物含量测定技术应运产生并不断完善发展。分光光度计检测技术、浊度计检测技术、荧光定量PCR技术、ATP生物发光技术等均已灵活运用于菌含量检测之中，基本可实现灵敏快捷、准确可靠地对为微生物进行计数。
早在1996年，乔军等[2]人就发现细菌菌液的吸光度与细菌数量之间有一定的线性关系。在2019年，李亭玉等[3]以大肠杆菌作为供试菌株，用分光光度计测定不同稀释倍数下大肠杆菌菌悬液的吸光值OD600，并用浊度计测定不同稀释倍数下大肠杆菌菌悬液的浊度，所测数据与平板计数法得到的菌含量联合，经过线性回归分析发现两种方法均呈现出良好的相关性，并得到其线性回归方程，成功构建一种用大肠杆菌菌悬液的OD600或浊度来表征其菌含量的方法。这种方法简单高效、结果准确，灵敏度和精确度尚可，不过目前大多用于测定细菌含量，关于真菌等微生物方面的应用前景有待进一步研究。
随着现代分子生物学的不断发展，具有高灵敏度和强特异性的定时荧光PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）被用于探索微生物计数方法[4]。有研究证实，在荧光信号指数扩增阶段，每个模板的循环阈值（Threshold cycle，Ct值）与其起始拷贝数的对数存在线性关系[5]。利用该原理，通过实验得到Ct值与活菌浓度对数值的标准曲线，后续实验只需用qPCR仪对未知样品测定Ct值就可计算出其初始浓度，得以构建一种以qPCR仪测得的Ct值表征待测菌株初始浓度的计数方法。
陈世琼[6]采用定时荧光PCR技术，建立了一种快速检测果汁中酿酒酵母的方法体系。通过实验验证该方法选用的定时荧光PCR反应体系中的探针和引物具有特异性，可准确、灵敏、快速地将酿酒酵母从其它酵母菌中鉴定出来。并对19个果汁样品分别用定时荧光PCR法和平板计数法进行酿酒酵母的数量测定，发现两种方法最终得到的检测结果一致,且该研究建立的定时荧光PCR检测方法的检测下限较低,可以到检测出单个酵母菌落。定时荧光PCR检测方法能够快速、灵敏地对果汁中的酿酒酵母进行准确检测,为实际生产中产品的质量控制提供了一种简单便捷、准确有效的检测手段。
荧光定量PCR检测方法安全快速、准确灵敏，可进行动态监测，适用范围广泛，但由于无法区分活菌死菌及VBNC状态细胞，在活菌计数实验中容易造成较大误差[7]。为解决这些问题，现主要是将一些核酸染色技术与qPCR技术相结合，利用核酸染料的选择渗透性和qPCR的特异性，能够区分活菌死菌及VBNC状态细胞，实现准确的活菌计数。
胡会龙等[7]以叠氮溴乙锭(EMA)作为染色剂，来消除死菌DNA造成的误差，经过一系列实验确定EMA的适宜处理条件，利用qPCR技术得到Ct值与乳酸菌含量对数值之间的标准曲线，与平板计数法进行对比分析发现EMAqPCR法结果更为准确。该实验研究通过构建EMAqPCR检测方法，能够快速准确地检测发酵饲料中活性乳酸菌的含量。
核酸染色技术与qPCR技术相结合的计数方法灵敏度高、特异性强、结果准确，可消除死菌存在情况造成的实验误差，还能够检测VBNC状态下的微生物，该方法目前多用于发酵食品中的活菌含量的测定。但该方法需要针对目标基因进行正确的引物设计，对目标菌株基因有一定的要求，并且需要通过一系列预实验来探索染色条件，前期准备阶段及方法体系的构建皆较为复杂，对实验设备也有一定的要求。现阶段研究中定时荧光PCR检测技术多针对于细菌，对真菌和病毒的研究较少。

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