目录
摘要Ⅲ
关键词Ⅲ
AbstractⅣ
引言
引言1
1 材料与方法3
实验材料3
1.1.1 所用菌株和细胞3
1.1.2 药品、试剂和酶3
1.1.3 溶液3
1.1.4 主要仪器装置5
1.2 实验方法 6
1.2.1 RDRs的系统发育分析6
1.2.2 OsRDR1功能域预测6
1.2.3 同源重组法构建载体6
1.2.4 OsRDR1表达量分析10
1.2.5 烟草瞬时表达蛋白12
1.2.6 蛋白表达量测定14
1.2.7 灰飞虱介导RDV病毒传播15
1.2.8 CTAB法提取DNA15
1.2.9 三引物法进行基因分型16
1.2.10 蛋白的原核表达及纯化16
1.2.11 考马斯亮蓝染色R25019
2 结果与分析20
2.1 OsRDR1的生物信息学分析20
2.1.1 常见植物RDRs的系统发育分析20
2.1.2 OsRDR1蛋白功能域探索22
2.2 OsRDR1基因功能验证22
2.2.1 OsRDR1基因表达量分析22
2.2.2 Osrdr1突变体鉴定23
2.2.3 OsRDR1过表达突变体鉴定25
2.3 蛋白的原核表达及纯化26
2.3.1凝胶过滤层析26
2.3.2考马斯亮蓝R250定量分析26
2.4 烟草瞬时表达蛋白29
2.4.1亚细胞定位观察29
2.4.2蛋白互作研究30
3 讨论32
3.1 OsRDR1基因功能验证32
3.2 OsRDR1与miRNAs*的积累33
3.3 Pulldown验证蛋白互作33
3.4 CoIP结合烟草瞬时表达探究OsRDR1功能域34
致谢35
参考文献3 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
5
OsRDR1在水稻抗RSV病毒中的机制研究
摘 要
水稻是我国以及世界范围内重要主粮作物之一，水稻条纹叶枯病是水稻生产上的重要病害，在我国的发生分布极广，严重威胁水稻生产，水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)是其病原。
依赖RNA的RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RDR)，以单链RNA为模板合成互补RNA链，产生双链RNA，从而参与产生多种小分子干扰RNA，在RNA沉默信号扩增、RNA沉默介导的抗病毒途径中扮演重要作用。本研究发现RSV侵染野生型水稻日本晴之后，其体内的OsRDR1基因会被诱导表达，同时发现OsRDR1缺失后植物抗 RSV 能力减弱，其过表达株系的发病表型也证明了这一点，说明 OsRDR1在抗RSV通路中扮演着正调控的作用。
高通量RNA测序结果表明，野生型水稻与rdr1突变体相比，感RSV后某些miRNA*被显著诱导，由此推测OsRDR1在miRNA产生过程中发挥作用。DRB1和SE是miRNA剪切小体Dicing body中的重要蛋白，NS3是RSV病毒编码的RNA沉默抑制因子，推测OsRDR1与上述蛋白存在互作。在植物活体内, 利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达蛋白, 继而通过CoIP进行鉴定，同时体外进行蛋白的原核表达及纯化，结合Pulldown验证，两条思路互为印证共同说明蛋白间的互作。
该研究对于进一步了解水稻条纹病毒致病机理以及水稻对该病毒的应答抵抗机制都有重要意义，为更好的防治水稻条纹叶枯病提供了依据。
FUNCTIONAL ANALYSIS OF OsRDR1 RESPONSIVE TO RISE STRIPE VIRUS INFECTION RESISTANT
ABSTRACT
Rice is one of the primary food source for China and all around the world. Rice stripe virus (RSV) is a viral disease that seriously impacts rice production in China. The widely spread of this disease posing a serious threat to rice production and grain security.
RNAdependent RNA polymerases (RDRs) could synthesize RNA complementary strand using singlestranded RNA as template to produce doublestranded RNA and small interfering RNAs, so it plays vital rules in RNA silencing pathways which was found as an important antiviral mechanism. Our results indicated that RSV infection induced high levels of OsRDR1 expression in rice. The rdr1 mutant plants were much more sensitive to RSV infection compared to the WT plants. Viral accumulation and infection rates were much higher in rdr1 mutant plants. These results suggest that OsRDR1 may be dispensable for normal growth and development of rice, but is required for defense against RSV infection. The OsRDR1 over expression lines exhibited more tolerant in comparison with WT rice plants to RSV infection. These data demonstrated that OsRDR1 may play a positive role in antiviral defense.

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/607337.html