:石细胞是由木质素在细胞壁沉积而形成的，是影响梨果实品质风味的主要因素之一，植物细胞的木质化过程主要包括三个步骤分别是木质素单体的合成、单体的转运和氧化聚合，每一步都由多种酶及其相应的基因进行调控,而过氧化物酶（Peroxidase，POD）在木质素的合成过程中起很重要的作用。本研究从梨果实中木质素合成角度，围绕POD在木质素合成中的作用这一科学问题，以新疆‘库尔勒香梨’为研究材料，通过对香梨果实发育过程中石细胞、木质素含量和酶活性变化，结合转录组数据及实时荧光定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），筛选出可能参与梨木质素合成的PRX基因，并使用PCR扩增候选基因PbPRX6，为探索PRX基因在梨果实木质素合成中的作用打下基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法 3
1.1 石细胞含量测定3
1.2 木质素含量测定3
1.3 POD酶活性测定3
1.4 PbPRX基因转录组数据分析4
1.5 梨果实不同发育时期果肉中RNA的提取与DNA的消化4
1.6 荧光定量PCR4
1.7 基因的克隆5
2 结果与分析6
2.1 石细胞含量分析6
2.2木质素含量分析6
2.3 POD酶活性分析 7
2.4 PODI酶活性分析7
2.5 PODII酶活性分析8
2.6 PbPRX基因荧光定量分析8
2.7 PbPRX基因家族表达模式分析9
2.8 PbPRX6基因的克隆10
3讨论11致谢12
参考文献13
香梨石细胞发育与过氧化物酶表达特性研究
引言
引言：梨属于蔷薇科梨亚科果树，梨果实风味奇特营养丰富品种多样备受消费者喜爱。‘库尔勒香梨’是目前重点发展的栽培品种之一，主产于新疆库尔勒市和阿克 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
苏等地，是新疆特有的品种，以其独特的风味和浓烈的香气而著名。但部分‘库尔勒香梨’果实外观畸形，果皮粗糙，果心大，石细胞多，造成‘库尔勒香梨’果实品质和风味的的降低[1]。石细胞是由薄壁细胞中木质素在次生壁沉积而形成的厚壁细胞，其形成首先开始于果实细胞分裂期，发生在果肉内部的深处，渐渐地向外发展，一直到盛花后100天单位面积的梨果实中石细胞含量会达到巅峰，而在此之后随着果实的生长发育果实内石细胞相对含量会渐渐减少，最后在果实发育成熟后石细胞含量趋于稳定[2]。石细胞的大小以及其分布的空间密度等都是梨果实品质方面的影响因素，石细胞越大，果实口感越差；石细胞越密集，梨果实品质越低。更多的研究发现梨果实中石细胞形成与很多因素有关，包括果肉中维生素C、糖酸比例、耐贮性、单宁含量pH值等[3]。近些年来，由于品种的退化、田间管理的粗放等不定性原因，有些品种的梨果实石细胞含量明显增多，导致果实品质低劣、口感不佳，严重影响其经济价值[4]，包括主产于新疆库尔勒市和阿克苏等地的‘库尔勒香梨’。
美国学者Ranadive 和Haard（1973）通过薄层层析法研究‘Yuzuhada’梨石细胞碱性硝基苯氧化所得产物时发现梨果实内部的石细胞中含有不到20%的木质素[5]。而影响梨果实内石细胞的分化以及发育完全离不开木质素的合成，因为木质素是石细胞薄壁细胞壁加厚的主要成分，梨果实内部的木质素含量与石细胞含量呈现显著的正相关性。Tao等（2009）以‘砀山酥梨’为研究材料通过化学测定、光激光共聚焦显微镜等一系列的技术研究报道‘砀山酥梨’果实内石细胞含量为果实鲜重的4%左右，并且发现该梨果实石细胞中木质素的含量可以达到30%[6]。此外，先前的研究还观察到木质素以片层状沉积于细胞壁形成石细胞的过程及梨果实石细胞典型的、高度木质化的应压木特征。综上可知，石细胞的形成离不开木质素，由于木质素不断沉积在细胞壁上，从而使次生细胞壁不断增厚，因此努力研究并有效控制木质素的合成可以减少石细胞含量，是提高梨果实品质风味的重要举措。
研究发现过氧化物酶（Peroxidase，POD）是木质素形成过程中的关键酶，其活性与木质素含量和石细胞含量成正比例关系[7]。细胞壁结合POD在木质素的合成过程中起到更关键性的作用，参与木质素合成的POD主要集中在细胞壁上，且细胞壁结合POD在‘新高’梨果实石细胞形成过程中起关键性作用[6]。POD是一种以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，通过苯丙烷代谢途径形成芥子醇、香豆醇、松柏醇等单体后，单体在POD氧化作用下脱氢聚合生成木质素[7]。POD虽然对于底物是没有专一性的，但是对于过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）是绝对专一的。POD可按催化底物的不同可以分为很多种，如抗坏血酸过氧化酶（APX），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPOD）和愈创木酚过氧化物酶（PPOD）等等。有研究通过分析参与梨木质素代谢的关键性POD的类型发现梨果实内木质素含量以及石细胞含量与PPOD的相关性是最强的，所以最终发现PPOD可能是参与木质素代谢的主要类型[7]。转基因白杨中抑制POD活性，发现在此过程中不仅是木质素的含量不断减少而且其组分也会有所变化，S/G比值也会变大[8]。
近些年来由于‘库尔勒香梨’的栽培面积不断扩大，管理上的粗放，自然环境的变化等各种环境、社会因素，这些都是引起果实石细胞增多的因素，导致果实肉质粗糙，品质下降较为严重，竞争力不断下降，严重影响生产的经济效益。正因如此，很多研究从果实品质形成机理方面入手，不断研究发现影响梨果实内外品质风味的主要因素，为梨果实品质的提升打下坚实的理论基础。本研究采用新疆梨品种‘库尔勒香梨’分析果实发育过程中石细胞、木质素含量和酶活变化，结合转录组数据及荧光定量PCR，筛选出可能参与梨木质素合成的POD基因以及果实整个生长发育过程中石细胞及木质素含量及木质素代谢过程中的关键酶POD活性。通过研究探索POD基因在梨果实木质素合成中的作用，为提高‘库尔勒香梨’产量，改善其内外品质提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 石细胞含量测定
选用健康优良、长势旺盛、管理水平一致的库尔勒香梨为试验材料，，分别于盛花后15 d、36 d、81 d、100 d和145 d采集果实样品。石细胞含量测定参照 Syros 等的方法，并根据实际情况稍做改动，具体操作步骤如下：分别选取三个大小较为均匀一致的果实（根据情况幼果可适当增加），刮去果皮，取样时按四分法取果实的食用部分，然后放至天平称量，准确称取100 g的样品后置于20 ℃低温冰箱冷冻，冷冻时间为24 h，取出样品置于室温内使其自动解冻，并在其中加入200 ml的蒸馏水，用组织捣碎机（10001500 rmin1）连续捣碎3 min，将匀浆转移到1000 ml的烧杯中，再向烧杯内加入700 ml蒸馏水，用玻璃棒不断搅拌，搅拌1 min后静置3 min，可以使石细胞充分沉淀至烧杯底层，然后把上层的悬浮液倒掉，把剩下的沉淀物悬浮在0.5 M的盐酸中30 min后，弃掉漂浮物，用干净的蒸馏水漂洗56次，将前面几次漂浮倾出来的悬浮液收集起来，进行漂洗。合并所得到的石细胞，用粗滤纸进行过滤操作，最后分离得到纯净的石细胞，烘干至恒重，称量，重复3次，记录数据，取平均值[9]。

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