葡萄的雌能花可以作为培育无核葡萄的优良品种，同时可以省去去雄工作，提高效率，减少树体养分消耗。所以关于雄性不育的研究在葡萄生产中具有重要的作用及经济价值。在这项研究中以雄性可育品种‘魏可’葡萄(Wink)及 雄性不育品种‘钟山红’葡萄(‘魏可’自交后代)作为为研究材料，分别克隆了可能与雄性不育相关的VviPPR基因，发现该基因在两种材料中存在明显差异，说明VviPPR基因与葡萄的雄性不育表达相关。通过生物信息学的预测表明，VviPPR基因编码了580个氨基酸，分子量为8999，pI为6.36，属于非分泌的亲水性蛋白。该基因的二级结构主要以无规卷曲以及α-螺旋为主要结构；通过亚细胞定定位预测分析该蛋白位于细胞质上的可能性是最大的；根据转录组数据的表达情况分析推测该基因在四分体期对雄性育性起作用。本研究为进一步探明该基因调控雄蕊育性的机制和功能研究奠定基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言 3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 VviPPR基因克隆4
1.2.2 生物信息学分析5
2 结果与分析5
2.1 VviPPR基因克隆5
2.2 VviPPR基因生物信息学分析6
2.2.1 氨基酸的序列同源性比对6
2.2.2 VviPPR基因的一级结构理化性质分析6
2.2.3 VviPPR基因的疏水性和磷酸化位点分析6
2.2.4 VviPPR基因的氨基酸信号肽和跨膜结构域分析7
2.2.5 VviPPR蛋白的亚细胞定位预测8
2.2.6 VviPPR蛋白的二级结构预测8
2.3 VviPPR不同时期的表达情况分析8
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
图1 ‘魏可’VviPPR基因的PCR扩增电泳结果5
图2 ‘钟山红’VviPPR基因的PCR扩增电泳结果6
图3 葡萄VviPPR与其他物种PP *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^ 
R蛋白的系统发育树6
图4 VviPPR氨基酸跨膜结构域的预测7
图5 VviPPR氨基酸的信号肽预测7
图5 VviPPR氨基酸跨膜结构域的预测7
图6 VviPPR磷酸化位点分析8
图7 VviPPR氨基酸疏水性预测8
图8 VviPPR在不同时期的表达情况9
葡萄雄性不育基因的克隆和表达
引言
雄性不育（Male sterility）是指雄蕊不能正常生长并在有性生殖过程中产生有效花粉，而雌蕊却可以正常发育和受精的现象。 在杂交过程中，雄性不育系材料可用于控制授粉，从而获得高产杂交品种[1]。 雌能花品种是在果树生产和育种中利用杂种优势的重要工具雌能花品种作为育性基因的突变体，也是研究雄蕊及花粉发育过程，育性基因表达、功能、调控网络以及雌雄异株植物的起源与进化的珍贵材料。在葡萄生产中，雌能花是培育优质无核葡萄的优良品种。同时雄蕊败育，降低树体的养分消耗。葡萄的花朵小而多，去雄工作困难，而利用雌能花品种可以解决这一问题，大大提高了杂交效率，所以在葡萄生产中具有重要的应用价值。
‘魏可’(Wink) 属于欧洲种葡萄[2]。2001年引入中国。果实紫黑色，味甜，多汁，无香气，每果含种子1～3粒，大部分为2粒种子，是一种优质、具有发展前景的极晚熟葡萄品种。同时，该品种产量高，易上色，外观漂亮，甜度适中且极耐运输和储藏。是葡萄品种中经济价值较高的品种[3]。而‘钟山红’由‘魏可’自交产生的雄性不育品种。
在分子层面关于葡萄的雄性不育研究也取得一些进展，郑焕[4]使用‘钟山红’和‘魏可’葡萄作为实验材料，在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2和VvMYB4同源性最高的葡萄序列，并设计了特异性引物用于克隆测序， 用实时荧光定量RTPCR技术表达两个葡萄品种在雄蕊发育不同阶段的表达特征，根据表达结果推测这两个基因的异常表达与‘钟山红’的雌能花形成有关。 VviMYB80在雄蕊发育中起重要作用，由35S启动子驱动的VviMYB80基因的表达对雄蕊产生多效性作用包括花药干枯较小和延迟开裂，种子减少，花药丝更短，花粉畸形、细胞质缺乏及绒毡层肥大[5]。季晨飞[6]以以可育葡萄‘魏可’作为亲本，利用BSA方法和SSR技术，选择了与葡萄雄性不育基因连锁的两个SSR标记VVMD34遗传距离为3.5cM和VVIB23遗传距离为1.9 cM。迄今为止PPR蛋白的结构特征基本清楚。PPR蛋白的N端序列大部分有叶绿体和线粒体的定位序列，而后是227个串联重复的PPR结构域，此结构域通过形成具有结合沟槽的超螺旋结构与单链RNA结合。在叶绿体及线粒体基因的转录后进行处理，从而进行细胞质雄性不育（CMS）相关基因表达的调控、参与植物的生长发育和形成胚胎的调控等方面发挥重要作用[6]。大多数PPR蛋白位于线粒体或叶绿体上，如拟南芥的OTP43蛋白位于线粒体上[7]。目前认为CMS是由线粒体基因及其相应的核恢复基因(Rf)共同控制，可以改变CMS相关基因在线粒体中的表达。这些蛋白的调控机制虽然暂时不明确，但是可以确定的是它们都对线粒体雄性不育诱导基因的阻断发挥了作用。进一步证明PPR蛋白表达细胞质雄性不育修复基因来自细胞器局部克隆的细胞质雄性不育恢复基因的证据[8]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本次试验在大学上峰果树基地及园艺果树生物技术实验室进行。试验材料为在上峰基地随机选取的生长健壮的可育‘钟山红’葡萄和可育‘魏可’葡萄果树。分别采集两个品种葡萄花穗样品，从3次生物学重复的植株上随机采集，取样时兼顾阴阳两面，用液氮速冻，于实验室－80 ℃冰箱中保存待用。
1．2 实验方法
1.2.1 VviPPR基因克隆
采用多糖多酚植物组织总RNA 提取试剂盒(成都福际公司产品) 提取实验材料的RNA，以TaKaRa公司生产的反转录试剂盒 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成的cDNA为模版，从葡萄全基因组数据库（https//:ncbi.nlm.nih.gov/
genome/401）中获得VviPPR基因序列并设计特异引物进行PCR扩增，反应体系(25.0 μl)为：稀释后的 cDNA 1.0 μl，5 × PrimeSTAR GXL buffer 5.0 μl，dNTP mixture 2.0 μl， PrimeSTAR GXL DNA polymcrace 0.5 μl上、下游引物各0.5 μl，灭菌后ddH2O 15.5 μl；反应程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸80 s，35个循环；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

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