质膜内在蛋白(PIPS)在干旱、盐分等胁迫中起重要作用，关于PIPS基因的克隆和序列分析等相关研究已经在拟南芥、水稻、大豆等作物中广泛研究，然而萝卜中研究较少，还没有较为准确的答案。本文从分子生物学方面对RsPIP2;1和RsPIP2;2进行分析，研究其在250mM/L NaCl盐胁迫下的表达特性，并对RsPIP2;1和RsPIP2;2进行克隆，构建过表达载体，为进一步研究RsPIP2;1和RsPIP2;2基因的功能奠定坚实的基础。主要研究结果如下1.RT-qPCR结果表明，萝卜自交系‘NAU-XBC’幼苗在250 mM∙L-1 NaCl胁迫处理后，RsPIP2;1和RsPIP2;2均呈现出不同的表达特性，表明NaCl胁迫可诱导萝卜RsPIP2;1和RsPIP2;2基因的表达。2. 从萝卜自交系‘NAU-XBC’中克隆了RsPIP2;1和RsPIP2;2基因，CDS序列长度分别为864bp和 852bp，并成功构建过表达载体pCAMBIA-RsPIP2;1和pCAMBIA-RsPIP2;2。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
绪论 3
1材料与方法 6
1．1 试验材料 6
1．2 试验方法 6
1．2．1 DNA、总RNA提取及cDNA合成 .7
1．2．2 过表达载体的构建 7
1．2．3 重组表达载体转化农杆菌 9
2 结果与分析 10
2．1 RTqPCR结果 10
2．2 RsPIP2;1和RsPIP2;2基因的克隆 11
2．3 大肠杆菌菌液PCR鉴定 11
2．4 双酶切验证 12
2．5 农杆菌菌液PCR鉴定 12
3 讨论 12
致谢 13
参考文献： 13
图1.250 mM∙L1 NaCl处理不同时间后RsPIP2;1和RsPIP2;2基因在根部的表达情况..10
图2.250 mM∙L1 NaCl处理不同时间后RsPIP2;1和RsPIP2;2基因在叶片的表达情况 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
.. 10
图3.萝卜RsPIP2;1（A）和RsPIP2;2（B）的扩增结果......11
图4.过表达载体pCAMBIA2301RsPIP2;1和pCAMBIA2301RsPIP2;2双酶切验证...12
图5.过表达载体pCAMBIA2301RsPIP2;1和pCAMBIA2301RsPIP2;2农杆菌菌液检测......12
表1 RsPIP2;1和RsPIP2;2基因克隆特异性引物序列...7
表2 RsPIP2;1和RsPIP2;2基因的RTqPCR引物.9
萝卜水通道蛋白PIP2;1和PIP2;2基因在盐胁迫下的表达分析及过表达载体的构建
引言
绪论萝卜是一二年生十字花科草本植物。在中国，萝卜栽培地域繁多，种植面积广阔，其栽培面积一直保持在蔬菜中的前三甲，品种多样化，按照栽培种分类可分为中国萝卜和四季萝卜。因其口感鲜美，并具有增强免疫力、消食化津、防癌抗癌等多种功效，具有非常有前景的消费者市场，所以说萝卜在中国蔬菜中占有重要地位。但是我们发现在市场上，带有耐盐性质的萝卜品种几乎没有生产。所以，耐盐性萝卜品种的大量培育一定会更加促进萝卜产业的繁荣发展，研究萝卜耐盐逆境响应将会起到非常重要的作用。大地孕育着无数鲜活生命，没有土地就没有现在的我们。但是现如今土壤盐渍化给土地带来了严重威胁[1]。一直以来，土壤盐渍化是全球共同面临的需要着手解决的长期生态问题。目前国内大部分的农田普遍存在土壤盐渍化现象，土壤盐渍化会造成影响作物健康生长、易发病虫害和降低农产品产量及品质等较深影响，其对农作物的种植效率起着极大的负面影响。同时，近几年来，中国蔬菜栽培面积在持续扩大和发展，由于在栽培中，不能有效控制肥料使用量并进行合理使用，并且采用不良的栽培方式，使得土壤盐渍化愈发严重[2]。同时，由于我国经济快速发展及人口增长，国家与人民对于蔬菜等大量农作物的需求在逐年上升，农作物的可持续发展课题占据着越来越重要的地位，与我们的生活逐渐息息相关、密不可分。因此，研究植物对于盐胁迫响应机理的重要性不言而喻，这将为农作物的可持续发展课题做出重大贡献。质膜内在蛋白(PIPS)是水通道蛋白的一种，因其定位在质膜上，介导了植物体细胞间的水分运输。在大豆、水稻等作物中己有关于PIPs基因的克隆和序列分析等相关研究。本试验采用RTqPCR技术，分析RsPIP2;1和RsPIP2;2基因在遭受盐胁迫后的表达特征，并对RsPIP2;1和RsPIP2;2基因进行克隆，对其序列进行比对分析，为进一步研究该基因功能打下理论基础。
1.盐分对植物生长发育与生理的影响和植物耐盐机理
1.1盐分对植物生长发育与生理的影响
有研究称, 80%的植物若是于含盐量达0.3%的土壤中培育，会受到盐胁迫的伤害。盐胁迫会抑制植物的正常生长, 土壤中含盐量的升高易造成植物根茎叶质量的降低及叶面积停止增加等抑制作用。有研究表明, 盐胁迫也可以通过抑制光合作用来减少合成的生长物质从而间接影响植物生长,且盐浓度越高,盐胁迫作用时间越长, 抑制植物生长效果越明显[3]。在盐胁迫状态下，最先影响的往往是细胞质膜，可能是由于盐胁迫加速植物内部活性氧自由基的生产和积累，从而积累大量的丙二醛、导致膜脂过氧化，增大细胞质膜的透性，抑制植物的健康生长[4]。盐胁迫在一定程度上会减小叶面积，降低叶绿素含量，使叶片气孔开度降低，从而影响光合作用稳定有效的进行[5]。盐胁迫使得植物的代谢活动发生不利波动，打破固有平衡状态，主要是因为碳水化合物、氨基酸等其他激素类物质含量发生一定程度的波动，相关的代谢活动有蛋白质代谢、氮代谢、碳水化合物代谢等。其中普遍认为，植物受到盐胁迫的主要原因是氮代谢的平衡破坏[6]。
1.2植物耐盐的机理
在盐胁迫状态下，植物接收到盐胁迫信号，之后，胁迫信号会被输送到细胞内部，最后转换成一系列加强植物适应性的代谢反应。外界盐分过高时，植物吸收外界离子，增加体内离子浓度，尽力使得内外离子浓度保持平衡。植物的耐盐机理有渗透调节、选择性吸收离子、改变光合作用途径和活性氧清除机制。植物主要有两种渗透调节：一种是离子调节——通过液泡吸收大量有害离子，一种是有机调节——细胞中自动产出蔗糖、氨基酸、脯氨酸等一定数量的有机调节物质。植物通过吸收K+而排斥Na+来进行离子的选择性吸收，从而调剂盐胁迫下的生理状态。植物改变光合作用主要有两种途径：一是改变碳同化途径，二是改变代谢途径。活性氧清除机制是指在盐胁迫状态下，植物体内产生大量可以组成活性氧清除系统的抗氧化保护物质，从而更有利地抵抗盐胁迫对植物生长的影响。

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