菊花cmmyb111的克隆与功能鉴定【字数：6373】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.2 实验方法 4
1.2.1 基因全长克隆及同源性分析4
1.2.2载体构建4
1.2.3 蚜虫胁迫下CmMYB111的表达量分析5
1.2.4 亚细胞定位6
1.2.5 转录激活活性分析6
1.2.6 农杆菌转化菊花6
1.2.7 转基因株系蚜虫接种实验7
2 结果与分析7
2.1 CmMYB111基因克隆以及氨基酸序列同源性对比7
2.2 蚜虫胁迫下的CmMYB111表达特性分析8
2.3 亚细胞定位8
2.4 转录激活活性分析9
2.5 CmMYB111转基因植株鉴定 9
2.6 转基因株系的抗蚜性鉴定10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
菊花CmMYB111的克隆与功能鉴定
园艺163 兰云希
引言
菊花，是我国的传统名花，因其独特的形态与缤纷色彩，颇受 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@
当代人的喜爱。主要应用在切花、盆栽、园林地被方面。除观赏之外，菊花还可以食用、茶饮、入药等，其利用价值在花卉中很高。切花菊的设施栽培技术占据了花卉生产的重要位置。但在其生产栽培过程中，容易遭受到如涝害、低温、干旱和蚜虫等非生物与生物胁迫的影响，从而影响菊花的品质。其中，蚜虫危害会导致菊花的产量及品质下降，蚜虫聚集数目过多时甚至会导致植株死亡。蚜虫胁迫对植物造成的危害已经严重影响到我国的菊花产业发展，防治蚜虫刻不容缓。蚜虫是最为常见的一种刺吸式昆虫，其繁殖能力、适应力极强，常以群体的形式集中分布于植物的叶片、茎干、顶芽等部位，并利用刺吸口针吸食不同植物的汁液。蚜虫的繁殖能力非常强，其繁殖具有明显的世代重叠现象。且雌性蚜虫能孤雌生殖，一出生就能够繁殖后代[1]。蚜虫在取食过程中分泌的蜜露会布满叶片。排泄的蜜露一方面吸引蚂蚁前来取食，另一方面影响植物正常的光合作用速率。此外，蚜虫迁飞扩散时，更容易造成多种植物病毒病的传播扩散，进一步危害植物的健康。菊花蚜虫主要分布于菊花叶片背面和花蕾中，大量的虫害会造成叶片卷曲皱缩，花冠变小，严重影响菊花品质[2]。因此，运用基因工程培育具有优良抗性的菊花新品种，是现代分子育种的重要方向，也对解决生产实际问题和菊花产业的发展有着重要的意义。
MYB 转录因子是一种螺旋转角螺旋蛋白[3, 4]，是植物中最大的转录因子家族之一。最早，Klempnauer等鉴定出了禽类成髓细胞瘤病毒（AMV）的vMyb 癌基因[5]，是首个被鉴定出MYB基因。在植物中，从1987年有学者在玉米中鉴定出COLORED1 （C1）基因编码的，主要调节控制植物细胞花青素合成的MYB类转录因子开始[6]，紧接着有许多的MYB转录因子在植物中被鉴定出来。
MYB转录因子能够影响植物不同的生物进程，包括关系到调控植物的生长发育、初级和次生代谢的调节、花器官与种子的发育、细胞分化、以及对生物和非生物胁迫的响应等[7]。
植物类黄酮通过参与级联信号反应能发挥自身的特异性，有效提升植物响应逆境的能力。植物的类黄酮代谢途径也有MYB转录因子的广泛参与[812]。近年来对MYB111转录因子的功能也有大量研究。MYB111基因的表达能影响转基因植物中黄酮醇的合成[1315]，从而提高植物的抗逆性。菊花CmMYB111基因对蚜虫抗性的具体作用还没有被详细阐明，克隆CmMYB111基因并鉴定其功能，有利于进一步完善菊花蚜虫抗性的研究，同时也对菊花种质资源的改良具有非常重要的意义。
1 材料与方法
实验材料
切花菊‘神马’。选取健康一致、无病虫害的插穗，扦插至体积比为2：1的蛭石和营养土的，底部打孔的塑料杯中，在温度为22 ℃，在光照长度为16 h，黑暗时间为8 h的条件下培养2周后，选取幼苗进行实验。选取的菊花幼苗为6~8叶龄，采集第三片真叶以上组织用于RNA提取和基因克隆。
实验方法
1.2.1 基因全长克隆及同源性分析
依据转录组数据库信息拼接，设计CmMYB111全长引物，以第一链cDNA作为模板，利用高保真PCR扩增以检测序列的可靠性。反应体系如下：
5×Phusion HF
10 μl
dNTPs Mixture (10 mM)
1.0 μl
上游引物
下游引物
1.0μl
1.0μl
DMSO
1.5 µl
cDNA
1.0μl
Phusion DNA Polymerase
0.5 μl
ddH2O
34 µl
Total
50 μl
经一系列反应程序后，对扩增产物检测，切胶，回收：①利用琼脂糖凝胶电泳反应上述产物，然后选取特异性条带进行切胶、纯化; ②将上述步骤①中的纯化片段进行加A尾，体系如下：
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/yy/607267.html
