菊花作为重要的切花，在生产过程中会受到蚜虫的危害，影响切花的观赏特性和经济价值。本项目旨在克隆菊花‘神马’CmHRE2基因,并分析鉴定其抗蚜功能。实验以菊花‘神马’为实验材料，依据其转录组数据库信息，克隆CmHRE2基因全长，ORF(开放性阅读框)全长为678bp；进行蛋白同源性分析发现该基因编码的蛋白与芜菁、烟草和拟南芥的HRE2亲缘关系较近；通过荧光定量PCR分析，发现CmHRE2在蚜虫胁迫下表达量显著下降；亚细胞定位在细胞核上，转录激活活性分析发现CmHRE2具有转录激活活性，发现134aa-225aa位置为激活区域。通过农杆菌介导法，获得菊花超表达转基因植株和SRDX融合抑制表达株系，并对野生型和转基因株系进行抗蚜性鉴定，发现CmHRE2增强了对蚜虫的敏感性，初步推测该基因负调控菊花的抗蚜性。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1植物材料 3
1.1.2载体与菌株 3
1.2方法3
1.2.1基因全长克隆及同源性分析3
1.2.2表达载体构建4
1.2.3蚜虫胁迫下CmHRE2的表达量分析4
1.2.4 CmHRE2转录激活活性分析及亚细胞定位4
1.2.5转基因植株获得及功能鉴定5
1.3数据统计与分析5
2结果与分析5
2.1菊花CmHRE2基因的克隆和同源比对5
2.1.1 CmHRE2基因的克隆5
2.1.2 CmHRE2编码蛋白的同源性比对分析6
2.2 CmHRE2在蚜虫胁迫处理下的表达量变化6
2.3转录激活活性分析和亚细胞定位 6
2.4转基因实验及CmHRE2基因功能鉴定7
2.4.1转基因植株获取7
2.4.2转基因植株鉴定8
2.5转基因功能鉴定9
2.5.1 CmHRE2转基因株系抗蚜性鉴定9
3讨论 10
参考文献11
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致谢13
菊花CmHRE2基因克隆与功能鉴定
引言
在植物体中乙烯路径参与了植物的盐、低温、干旱和淹水胁迫等非生物胁迫和对病原菌和一些有害昆虫的生物胁迫响应表达。HRE2属于ERF(Ethylene response factors, ERF)转录因子家族，ERF转录因子家族是植物所特有的基因家族(BerrocalLobo et al., 2002; Chen et al., 2008; Dong et al., 2010)，该家族转录因子参与植物生物胁迫和非生物胁迫，具有极大的挖掘潜力(Nakano et al., 2006)。缺氧、干旱和病虫害等不良外界环境都会诱导该家族基因选择性表达，通过直接调控乙烯路径的组成成分或者是间接参与其他激素路径来响应各种胁迫(Kazan et al., 2014; Kazan et al., 2015)。拟南芥中HRE1和HRE2基因能够迅速响应缺氧胁迫(Dongen et al., 2009); ERF基因LeERF2在转基因烟草中表达上调乙烯含量，提高烟草的抗冻性(张执金等，2007)，超表达的番茄LeTERF1正调控番茄和烟草的病原抗性(张洪博, 2005); 负调控烟草中的渗透响应，但提高了水稻的耐干旱性(Quan et al., 2010; Zhang et al., 2007)。而菊花中ERF家族基因CmHRE2的克隆及其功能鉴定研究尚未见报道。
菊花(Chrysanthemum morifolium)是世界四大切花之一，其中‘神马’是菊花鲜切花生产上主栽的白色大菊品种，有极高的观赏价值，在生产过程中，易遭受蚜虫危害，蚜虫是一种最为常见的刺吸式昆虫，其繁殖能力、适应力极强，常群集性集中于植物的叶片、茎干、顶芽等地上部位吸食植物汁液，造成叶片卷曲、皱缩，降低菊花生产的产量和质量，危害严重时能引起植株枯萎甚至死亡，因此，蚜虫的有效防治一直是植物生产上有待解决的难题。根据已有研究，植物在进化中，对蚜虫的防御机制分为两种，一种是常规的生理防御机制，另一种是分子防御机制(Xia et al., 2014)，蚜虫取食能使植物产生大量活性氧，活性氧作为信号物质能够诱导植物激素信号转导，相关植物抗性的转录因子如ERF、WRKY、MYB在转录水平上对次生代谢物质合成相关基因进行调控，产生防御反应，来抵御蚜虫取食。
本研究采用高保真PCR方法从菊花‘神马’中克隆了CmHRE2基因全长，并分析该基因蛋白序列与其他物种的HRE2同源性。采用实时荧光定量PCR技术对该基因在蚜虫接种的胁迫处理下叶片内的表达量进行分析，并进一步进行亚细胞定位和转录激活活性分析，确定该基因表达位置及活性区域; 构建载体并获得转超表达株系和SRDX功能沉默株系，探究其抗蚜性并测定了相关激素总黄酮含量水平，初探CmHRE2参与菊花对抗蚜性的调控机制，为菊花实际生产中地上部蚜虫危害提出理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
供试菊花品种‘神马’取自大学菊花种质资源保存中心。选取生长健壮、长势一致的插穗进行扦插繁殖，定植至含蛭石和营养土(体积比为 2∶1) 的塑料杯(底部打孔)中，在 22 ℃，光照/黑暗为 16 h/8 h 条件下培养 4 周，选取 6～8 叶龄的幼苗作为供试材料。
1.1.2 载体与菌株
入门载体pERNTR1A、pGBKT7酵母表达载体、pMDC43超表达载体、pSRDX抑制表达载体、大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105均由大学菊花实验室保存。
1.2 实验方法
1.2.1 基因全长克隆及同源性分析
在‘神马’转录组库中通过比对查找CmHRE2序列，用 RNAiso Plus 试剂盒(TaKaRa) 提取‘神马’叶片总RNA，反转录得到cDNA，以第一链cDNA为模板通过高保真PCR克隆菊花CmHRE2全长。高保真酶反应体系与程序如下：

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