类胡萝卜素是胡萝卜中一种重要的次生代谢产物。黄色胡萝卜中主要含有叶黄素，而橙色胡萝卜中主要含有α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。橙色胡萝卜从黄色胡萝卜突变选育而来。已有研究表明许多基因位点会调控类胡萝卜素合成。其中Y2基因位点是控制胡萝卜由黄色变为橙色的关键位点。前人研究表明，Di19基因很可能就是Y2基因。本研究从‘黄石’胡萝卜克隆了这个Y2候选基因，获得长为630 bp的基因片段，共编码209个氨基酸，结构域预测表明Y2基因属于zf-Di19超级家族，将基因转入橙色胡萝卜‘黑田五寸’中获得了转基因幼苗。为后期其功能鉴定打下了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1 提取RNA并反转录成cDNA4
1.2.2 胡萝卜Y2基因的克隆5
1.2.3 碱基序列分析5
1.2.4 农杆菌介导法转入目标胡萝卜 5
1.2.5 GUS染色6
2 结果与分析6
2.1 胡萝卜Y2基因的克隆6
2.2 Y2基因序列分析7
2.3 胡萝卜Y2基因蛋白的结构域预测分析8
2.4 载体构建8
2.5 农杆菌侵染9
2.6 GUS染色分析9
3 讨论 10
致谢10
参考文献11
胡萝卜中Y2基因的克隆分析和遗传转化
引言
胡萝卜(Daucus carota L.)属于伞形目(Apiales)伞形科(Apiaceae)胡萝卜属，是一种两年生的草本植物，染色体的数目为2n=2x=18。胡萝卜是全球性的十大蔬菜作物之一，适应性很强，易栽培，除了南极洲之外在世界上的其他各州都有广泛种植[1]。在16世纪初期的西欧，白色的胡萝卜和橙色的胡萝卜第一次出现[2,3]。公元1700年，亚洲出现了一种红色的胡萝卜，在当时被记载[4,5]。肉质根是胡萝卜的主要食用部位，现如今在全球范围内种植的胡萝卜的肉质根有各种不同的颜色， *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: #351916072# 
分别是：橙色、紫色、黄色、红色和白色，这些胡萝卜的颜色由各种不同的色素所决定，最常见的橙色胡萝卜中富含胡萝卜素、紫色胡萝卜富含花青苷、黄色的胡萝卜富含叶黄素、红色的胡萝卜富含番茄红素、而白色的胡萝卜则不含或含有非常少量的色素。
类胡萝卜素是一类数量极为庞大的重要天然色素，是维生素A前体物质的主要来源。维生素A是人类饮食中重要的营养组成部分，能维持正常视觉功能，促进免疫球蛋白的合成，维持骨骼正常生长发育，促进生长与生殖[6]。类胡萝卜素由所有光合生物（植物、藻类和蓝藻）以及一些、非光合细菌和真菌合成[7,8]。大多数植物中红色、橙色和黄色的主要发色团基本都是类胡萝卜素。例如成熟的番茄和西瓜中的番茄红素，辣椒中的辣椒红素和花椰菜中的β胡萝卜素。而胡萝卜的肉质根是类胡萝卜素积累最为丰富的蔬菜作物器官之一，其中富含叶黄素、α胡萝卜素和β胡萝卜素等多种生物活性色素[912]。类胡萝卜素大多数不溶于水，易溶于脂溶剂，性质不稳定，在空气中易氧化。类胡萝卜素是一种抗氧化剂，能减少免疫细胞的氧化损伤，具有解毒作用，能抗肿瘤、降低心血管疾病和癌症发病率，还能促进某些白细胞介素的产生而发挥免疫调节功能，预防和改善老年性眼部退行性病变，保护视网膜免于光损害等多种生物学作用[13]。
类胡萝卜素可以在所有类型的质体中合成，在植物绿色组织的叶绿体以及根部，果实和花瓣的有色体中高水平积累。类胡萝卜素在细胞中的积累是生物合成，降解和稳定存储的结果。因此，类胡萝卜素前体的合成，类胡萝卜素合成以及环氧化分支这三个过程的调节代表了园艺作物中类胡萝卜素积累的主要机制。关于非模式园艺蔬菜作物中对于类胡萝卜素调节的大多数研究都集中在类胡萝卜素途径基因的转录调节上[1417]。园艺作物在非绿色器官中合成和积累大量的各种类胡萝卜素。在许多蔬菜中，类胡萝卜素生物合成的第一个调控水平是通过生物合成基因转录的控制。
类胡萝卜素的生物合成途径的生化步骤早已建立。鉴定编码类胡萝卜素酶的基因近二十年来已取得部分进展，在植物中已经发现了所有催化类胡萝卜素生物合成和降解的核心反应的酶，各种园艺作物中大量与类胡萝卜素合成和降解途径相关的基因已被大量克隆和研究。
已知多种调节水平会影响类胡萝卜素的生物合成和积累，以响应代谢，发育和环境信号。类胡萝卜素代谢途径的转录调控基因是如今园艺作物研究的主要重点，并且大量基因已显示出在调控类胡萝卜素含量和色素组成中的重要作用。然而，对于类胡萝卜素合成的相关基因在植物中表达的调控机理尚且不够清楚。如今已经确定了几种直接控制类胡萝卜素积累水平的调控基因和蛋白质，早期研究发现胡萝卜肉质根中类胡萝卜素的合成积累与一些单基因位点有关，如Y2基因位点抑制胡萝卜中α胡萝卜素和β胡萝卜素的合成，从而能使得胡萝卜呈现黄色[18]。但是，此前对许多水果和蔬菜进行的QTL分析可见，类胡萝卜素的代谢基因通常不是决定类胡萝卜素水平的主要遗传位点。转录调控基因与决定类胡萝卜素含量的主要QTL不共分离[1921]。
在此研究的基础上，本实验将以黄色的‘黄石’胡萝卜和橙色的‘黑田五寸’胡萝卜作为实验原料，为深入研究Y2基因的相关生物调控，通过基因克隆，对该基因以及该基因编码的氨基酸序列进行生物学分析，通过转基因等试验手段来验证Y2基因是否为抑制胡萝卜肉质根的α胡萝卜素和β胡萝卜素合成的关键基因，进一步探究Y2基因对类胡萝卜素色素表达的影响，此研究将促进不同颜色的胡萝卜中类胡萝卜素合成的分子机理解析。本课题将对胡萝卜在颜色方向上的分子设计育种，提供一套新的理论基础和指导。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本实验以‘黑田五寸’橙色胡萝卜以及‘黄石’黄色胡萝卜为材料。上述两种用于实验的胡萝卜种子由大学作物遗传与种质创新国家重点实验室伞形科蔬菜课题组提供。将上述两种具有代表性的不同类型的胡萝卜材料种子于2019年6月种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。在适宜的温度、湿度、光照、营养条件下，培育90天后，选取‘黄石’黄色胡萝卜的肉质根样品，采取样品应大小接近、成熟度相对一致，并且无病害、虫害、没有机械伤害等，如此才能确保实验结果有效且具有参考意义。用液氮迅速将样品冷冻，放置于80 ℃的冰箱保存备用。

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