类胡萝卜素是一种在自然界中广泛分布的色素且最早从胡萝卜肉质根中提取得到。而类胡萝卜素的积累同时也会影响胡萝卜肉质根的颜色及营养价值。本课题实验从‘黑田五寸’胡萝卜中克隆了CYP97B2基因，并将其连接35S启动子后构建到pCAMBIA1301载体上，而后电击转化至农杆菌中。利用农杆菌介导法将CYP97B2基因转入‘黑田五寸’外植体，使得其在外植体中过量表达。最后通过脱分化和再分化获得了转基因胡萝卜植株。进一步培养后，观察比较了转CYP97B2基因和转pCAMBIA1301空载体‘黑田五寸’胡萝卜的表型差异。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 研究材料与试剂 3
1.2 提取总RNA和cDNA的反转录 3
1.3克隆CYP97B2基因并分析3
1.4目的片段的回收与连接3
1.5对大肠杆菌进行转化并鉴定阳性菌株3
1.6胡萝卜CYP97B2转基因植物表达载体的构建与农杆菌转化4
1.7 CYP97B2基因转化与培养4
1.7.1 B5培养基的配制4
1.7.2外植体培养 4
1.7.3农杆菌侵染5
1.7.4愈伤组织和转基因植株培养5
1.8 GUS染色实验5
1.9继续培养转基因植株并进行观察与测量5
2结果与分析5
2.1 CYP97B2基因克隆结果5
2.2 CYP97B2基因碱基序列、氨基酸序列与结构域预测结果6
2.3载体图8
2.4转基因‘黑田五寸’胡萝卜植株8
2.5转基因植株GUS染色结果9
2.6转基因植株与空载体植株对比10
3讨论10
致谢11
参考文献11
CYP97B2基因的克隆分析和遗传转化
引言
在园艺作物（花卉、水果和蔬菜）中，产品颜色代表了一个重要的质量特征，从而增强了产品多样性和市场细分机会[1]。目前许多针对类胡萝卜 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
素生物合成的研究集中在果实、种子和花器官中不同颜色的发育，如柑橘、番茄、胡椒、玉米、万寿菊、菊花以及水稻[211]。对地下器官的大多数研究都集中在马铃薯块茎上，对根中类胡萝卜素合成的控制知之甚少[12]。
类胡萝卜素作为一种重要的营养物质，广泛存在于胡萝卜中[13]。类胡萝卜素通常存在于园艺作物的光合作用和非光合作用组织中。在具有光合作用的组织中，类胡萝卜素具有收集光照与保护植物的作用。而在非光合作用的组织中，类胡萝卜素能够使植物呈现出较为鲜艳的颜色并形成特殊的气味，以此吸引昆虫和其他动物进行授粉与种子传播。类胡萝卜素作为广泛存在的天然色素,参与植物光合作用,赋予植株器官丰富的颜色,是植物激素(例如脱落酸、独角金内酯)的前体物质,对植物生长和发育以及细胞膜的稳定性起着关键性作用[14]。
类胡萝卜素在对于植物来说至关重要，对于人类来说同样也是必不可少。随着生活质量的提升，“三高”人群越来越多，由此引发冠心病和脑梗死发病率迅速上升。而类胡萝卜素能够预防由“三高”引起的疾病，例如动脉粥样硬化。除此以外，从水果蔬菜中摄取一定量的类胡萝卜素能够使癌症的发病率降低。今年的新型冠状病毒疫情也让人们开始关注自身的免疫能力，在众多能够提升人类机体的免疫功能的物质中就包含类胡萝卜素。类胡萝卜素中所包含的番茄红素和β胡萝卜素主要通过减少氧化所带给免疫细胞的损伤，同时促进部分白细胞介素产生，从而发挥免疫调节功能。另外，类胡萝卜素还能保护视网膜，减少蓝光形成的光损害。总而言之，类胡萝卜素具有的抗氧化、抗癌、增进免疫力以及保护视力等功效对于人类来说都是十分重要的。
由于类胡萝卜素仅能由植物和微生物自行合成，动物自身并不能生物合成类胡萝卜素，所以人类主要依赖于食用植物性食物来获取类胡萝卜素。人体每天所需要摄入的类胡萝卜素大约为6毫克。经常食用富含类胡萝卜素的食物有益于身体健康。因此，在人们的日常饮食中，类胡萝卜素可以说是必不可少的一种营养物质。由此，我们可以肯定，类胡萝卜素作为一种极具研究价值的天然色素，仍然有很大的探索空间与研究价值。
类胡萝卜素是由异戊二烯骨架构成的C40或C30萜类化合物,是一类重要的天然色素的总称[15]。典型的类胡萝卜素是由8个异戊二烯单位首尾相连形成。类胡萝卜素的颜色因共轭双键的数目不同而变化[16]。一般来说，共轭双键的数目越多, 颜色越会移向红色。类胡萝卜素成分的差异导致白色、黄色、橙色和红色等各种颜色[17]。
根据化学结构的不同可以将其分为两类, 一类是胡萝卜素 (只含碳氢两种元素, 不含氧元素, 如β胡萝卜素和番茄红素)，另一类是叶黄素 (有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团, 如叶黄素和虾青素)[16]。常见园艺植物中主要包含胡萝卜素、叶黄素和番茄红素。例如，西蓝花、菠菜和哈密瓜等蔬菜水果中含有胡萝卜素；番茄、西瓜、葡萄柚及番石榴等水果中含有丰富的番茄红素。
胡萝卜是一种根茎类蔬菜，一般在根部积累有大量的类胡萝卜素。因此，胡萝卜是众多研究根器官类胡萝卜素生物合成与调控机制的良好模型之一。在先前的研究中，肉质根颜色不同的胡萝卜中类胡萝卜素的积累是各不相同的。例如在橙色和紫色胡萝卜的肉质根中，韧皮部中类胡萝卜素的含量显著高于木质部中类胡萝卜素的含量；而在红色基因型胡萝卜中，韧皮部和木质部中类胡萝卜素的含量极为相似。人们认为，胡萝卜肉质根组织中类胡萝卜素积累的差异是由于特定组织中类胡萝卜素生物合成基因表达模式的不同所导致。综合上述研究现状，胡萝卜是一种理想的研究对象，对于研究类胡萝卜素生物合成与调控机制来说具有十分重要的意义。
当下，针对影响类胡萝卜素的生物合成途径或是种类的研究内容及范围已经十分广泛深入。根据现有的科研成果及相关论文，可以推测CYP97家族基因与类胡萝卜素的积累和颜色表达有很大的相关性。例如，已有研究表明CYP97A3基因与α胡萝卜素的积累有关。因为CYP97A3基因在橙色胡萝卜中的过表达能够显著降低根系中α胡萝卜素水平[18]。但是大多数研究都是针对CYP97A亚家族基因（例如CYP97A3和CYP97C）基因，当下对于CYP97B2基因的研究较为少见。

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