胡萝卜的Orange基因家族中有三个基因，本课题将其分别命名为OR1、OR2、OR3。本课题选用‘黑田五寸’胡萝卜，运用PCR扩增方法获取三个Orange基因。碱基序列分析表明，OR1、OR2和OR3基因长度相近，分别为933 bp、858 bp和939 bp。氨基酸序列比对分析表明，三个Orange基因编码的氨基酸序列相似性较高，尤其C端的相似性比N端更高。对这三种氨基酸进行蛋白质结构域预测表明，这三个Orange基因编码的三种蛋白同属于植物DnaJ_zf超级家族，结构域都在C端。系统进化分析表明，胡萝卜的OR1和OR2与黄花蒿的Orange进化关系较近，胡萝卜的OR3与三裂叶薯的Orange进化关系较近。通过荧光定量PCR，检测胡萝卜中三个Orange基因在胡萝卜不同生长时期的表达量。结果显示，三个基因当中，OR2基因表达量最低，OR3基因的表达水平最高。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1 材料与方法6
1.1 试验材料 6
1.2 RNA提取与cDNA合成6
1.3 引物设计与PCR扩增6
1.4 荧光定量PCR系统6
2 结果与分析7
2.1 胡萝卜中三个Orange基因克隆7
2.2 胡萝卜中三个Orange基因测序7
2.3 胡萝卜中三个Orange基因编码氨基酸及序列比对8
2.4 胡萝卜中三个Orange蛋白结构域预测与分析8
2.5 胡萝卜中三个Orange基因系统进化分析9
2.6 胡萝卜中三个Orange基因在不同生长时期特异性表达分析11
3 讨论11
致谢12
参考文献13
胡萝卜三个Orange基因克隆与表达分析
引言
引言
胡萝卜(Daucus carota L.)属于伞形目(Apiales)伞形科(Apiaceae)胡萝卜属，两年生草本植物，染色体数为2n=2x=18。胡萝卜适应性强，易栽培，种植十分普遍，是全球性十大蔬菜作物之一。除南极洲外，其余各 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
洲都有广泛种植。近十年来，我国胡萝卜每年的总产量占全世界产量的三分之一左右，是当之无愧的世界第一大胡萝卜生产国。
类胡萝卜素是一类由异戊二烯碳骨架组成的C40或C30萜类化合物，是一类重要的、广泛存在于自然界的天然色素的总称。类胡萝卜素的最初发现是19世纪分离出了胡萝卜素，到目前为止已有近800种天然类胡萝卜素被发现。类胡萝卜素的分子组成中有大量的共轭双键结构，在可见光下可以呈红色、橙色或黄色。类胡萝卜素在高等植物的光合作用过程，将光能传递给叶绿素，起到天线色素的作用，此外也有清除自由基以及光保护的功能[1]。此外，它还可以吸引鸟类和昆虫，进行种子和花粉的传播[2]。类胡萝卜素不仅对果实颜色变化和各种激素的产生起着重要作用，还影响着果实的外观和品质，从而对园艺作物的商业价值产生影响。
类胡萝卜素在高等植物中进行生物合成的亚细胞定位是质体。异戊二烯焦磷酸(isoprene pyrophosphate, IPP)是类胡萝卜素的前体，IPP是在质体中经由2C甲基D赤藓醇4磷酸(2CmethylDerythritol4phosphate, MEP)途径合成的。MEP途径的最后反应步骤的酶是羟甲基丁烯基4磷酸还原酶(hydroxymethyl butenyl4phosphate reductase, HDR)，它能催化IPP和二甲基丙烯焦磷酸(Dimethyl propylene pyrophosphate, DMAPP)的合成，IPP和DMAPP可以在异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)的作用下相互转换[3]。最后，在IPP异构酶(isopentenyl pyrophosphate isomerase, IPI)和双（牻牛儿基）焦磷酸合酶(geranylpyrogeryl pyrophosphate synthase, GGPPS)的作用下，DMAPP与3分子IPP缩合成C20的双（牻牛儿基）焦磷酸(geranylpyrogeryl pyrophosphate, GGPP)。双（牻牛儿基）二磷酸(GGPP)是合成类胡萝卜素的直接前体物质，在类胡萝卜素生物合成的初始阶段，两分子的GGPP缩合为无色的八氢番茄红素，这步反应由八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, PSY)催化完成。PSY是目前为止研究最多最深的一种类胡萝卜素代谢酶，是一种对植物组织、器官中类胡萝卜素的总累积量的起决定作用的核心酶八氢番茄红素转变成粉色的全反式番茄红素，此步反应由八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)、ζ–胡萝卜素异构酶(ζcarotene isomerase, ZISO)、ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζcarotene desaturase, ZDS)和胡萝卜素异构酶(carotene isomerase, CRTISO)四种酶共同催化完成。天然类胡萝卜素的主要结构是反式的，因此天然条件的类胡萝卜素合成的一个重要步骤就是异构化作用。催化这一结构转化步骤的关键异构酶就是ZISO和CRTISO[4]。类胡萝卜素的生物合成中一个主要分支点就是番茄红素的环化，在植物里一般有两种番茄红素环化酶（lycopene βcyclase, LCYb和lycopene εcyclase, LCYe），直链番茄红素的下游产物也分别对应着两个分支。LCYb可以催化番茄红素的两个末端对称地各生成1个β环。当其中一端被环化，即生成γ–胡萝卜素，当另一端也被环化，则生成β–胡萝卜素。而LCYe通常只能使番茄红素的其中一端生成ε环，即生成δ–胡萝卜素，另一端则再被LCYb催化，生成α–胡萝卜素。
对调控类胡萝卜素生物合成的有关基因进行超量表达，可以提高植物中类胡萝卜素生物合成速率，促进植物中类胡萝卜素含量的富集。同样地，对类胡萝卜素生物合成的相关基因的表达进行抑制，可以使上游产物的含量累积。有研究表明，番茄果实在生长发育的过程中，1–脱氧–D–木酮糖–5–磷酸合成酶基因(1deoxyDxylose5phosphate synthetase, DXS)的表达水平与植物组织中类胡萝卜素的累积量呈正相关。对马铃薯块茎进行DXS超量表达，β–胡萝卜素和八氢番茄红素的积累明显升高[5]。八氢番茄红素合成酶基因(PSY)被多种因素调控。该基因的启动子含有ATCTA顺式作用元件，该元件被认为是PSY表达受光调控的主要作用元件。PSY和MEP途径基因表达受昼夜光照规律的影响，光敏色素对这两者的活性进行调控[6]。光敏色素介导光形态建成，在这一过程中，PSY的表达与之呈正相关。PSY的表达能被红光和远红光提高[7]。光也可通过蓝光受体（向光素和隐花色素）来影响玉米的ZmPSY2的表达[8]。除此之外，光敏色素作用因子(phytochromeinteracting factor, PIF)对PSY的表达进行直接调控[9]。过量表达PSY，也可以在一些原先类胡萝卜素少量累积的组织或器官中提高类胡萝卜素的含量[10]。CrtB编码微生物中PSY基因，功能与植物中的PSY相近，由于这一基因的高活性，植物类胡萝卜素代谢调节中CrtB得到广泛使用。八氢番茄红素脱氢酶基因PDS与PSY一样，启动子上都有ATCTA光调控顺式作用元件[6]。在橘橙的愈伤组织中，光照诱导胡萝卜素异构酶基因CRTISO的表达大约高12倍[11]。拟南芥的CRTISO缺失突变体延迟转绿，同时叶黄素含量大幅下降，水稻和番茄的CRTISO突变体也存在一致的表型[12]。在番茄的成熟果实中，超量表达番茄红素β–环化酶基因LCYb促使番茄红素向β–胡萝卜素的转化更加高效[13]。β–胡萝卜素羟化酶基因(βcarotene hydroxylase, BCH)对强光敏感，该基因的表达受强光诱导，而紫黄质脱氧环氧酶基因(violaxanthin deepoxidase, VDE)表现相反[14]。过量表达BCH可以改变番茄组织中类胡萝卜素的组分构成，富氧的类胡萝卜素含量提高，植物抗强光的能力得以提高[15]。对马铃薯块茎中番茄红素ε–环化酶基因LCYe的表达进行抑制，β–胡萝卜素和总类萝卜素的含量有明显的富集[16]。玉米黄质环化酶基因(zeaxanthin epoxidase, ZEP)的表达进行抑制，能够使马铃薯块茎中玉米黄质和总类胡萝卜素的含量显著增加[17]。

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