以11个不同品种盆栽小菊为试验材料，研究不同6-BA和NAA配比、抗生素浓度对无菌苗叶盘和茎段外植体愈伤组织诱导、不定芽再生及生根的影响。用农杆菌转化法将GUS基因转入‘微风深红’叶盘。主要结果如下筛选出再生频率最高达95.0%的盆栽小菊品种‘微风深红’，其叶盘再生最适分化培养基为MS + 6-BA1.0 mg·L-1 + NAA0.2 mg·L-1；15 mg·L-1 卡那霉素和10 mg·L-1潮霉素为叶盘分化的最适选择压；10 mg·L-1卡那霉素和8 mg·L-1潮霉素为茎段生根的最适选择压；羧苄青霉素抑制农杆菌的最适浓度范围为200 - 400 mg·L-1；获得GUS染色呈现阳性的‘微风深红’愈伤组织。本研究初步建立了盆栽小菊叶盘外植体的高效再生及转化体系，为菊花的转基因工作奠定了良好基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.1.1 试验材料 4
1.1.2 化学试剂 4
1.1.3 培养基类型4
1.1.4 根癌农杆菌工程菌液4
1.2 方法5
1.2.1 无菌苗的获得5
1.2.2 不同盆栽小菊叶盘外植体再生激素配比筛选5
1.2.3 叶盘不定芽再生的抗生素浓度筛选 5
1.2.4 茎段生根的抗生素浓度筛选5
1.2.5 羧苄青霉素抑菌浓度的筛选5
1.2.6 农杆菌介导的遗传转化5
1.2.7 转基因组织GUS染色6
2 结果分析6
2.1 叶盘再生不定芽的激素浓度配比筛选 6
2.1.1 卡那霉素Km浓度对叶盘再生不定芽的影响8
2.1.2 潮霉素Hyg浓度对叶盘再生不定芽的影响9
2.2 茎段生根的抗生素浓度筛选10
2.2.1 卡那霉素Km浓度对茎段生根的影响10
2.2.2 潮霉素Hyg浓度对茎段生根的影响10
2.3 羧苄青霉素Cb抑菌 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
浓度的筛选11
2.4 GUS染色13
3 讨论13
致谢14
参考文献15
附录A MS培养基配方17
附录B YEB培养基配制方法18
盆栽小菊高效再生和遗传转化体系的建立
引言
菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）被称为“花中君子”，是我国传统名花和传统插花的重要花材，也是世界重要的切花。其花色丰富，花型多样，花姿优美，观赏价值极高，深受人们的青睐。遗传转化技术可以定向改良花期、花色、花型、抗病性等性状，是现代菊花育种的重要手段之一。菊花再生体系的研究开始于1968年Hill的再生实验[1]，目前人们已经以不同品种菊花的叶片[23]、叶柄[4]、茎段[5]、花瓣[67]等为外植体，建立了再生体系。与花瓣、茎段材料相比，叶片具有取材方便，可取材时期更长，分化率较高等特点，成为了菊花遗传转化研究的常用材料[8]。研究表明，影响菊花再生的主要因素是基因型差异[9]，不同基因型菊花的再生体系存在差异，菊花的再生体系不具有普遍性[10]。遗传转化的成功依赖于高效的菊花再生体系，且具有稳定性和重复性[5]。对于盆栽小菊再生转化体系的研究目前尚鲜有报道，盆栽小菊具有株型矮小、生长周期短等特性，建立盆栽小菊完善的再生和转化体系，不仅有利于组培快繁与分子育种相关工作的开展，还有利于转基因功能的鉴定等研究。
本研究以11个盆栽菊的叶盘为外植体，在含有不同6BA和NAA配比的MS培养基上培养分化出不定芽，建立了‘微风深红’的高效再生体系。筛选了‘微风深红’叶盘再生和茎段生根的卡那霉素、潮霉素选择压，抑菌剂羧苄青霉素的抑菌浓度。在此基础上，利用农杆菌转化法将GUS基因转入叶盘，并进行GUS染色验证。本实验初步建立了‘微风深红’的再生转化体系，为其今后的转基因工作奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
所有试验材料由大学菊花遗传育种与分子生物学实验室提供，实验在大学菊花遗传育种与分子生物学实验室和实验中心组培室进行。
1.1.1 试验材料 盆栽小菊品种：‘微风深红’、‘花洒绿色心情’、‘色彩火山’、‘微风橙绿’、‘微风玫瑰’、‘微风索尔’、‘青柠水晶’、‘梦幻粉水晶’、‘红水晶’、‘微风红霞’和‘粉色’。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株：EHA105。
质粒：pCAMBIA1301GUS。
1.1.2 化学试剂 植物激素6苄基腺嘌呤（6benzyladenine，6BA）、萘乙酸（Naphthaleneacetic acid，NAA）、抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）、抗生素潮霉素（Hygromycin，Hyg）、羧苄青霉素（Carbenicillin，Cb）、利福平（Rifampicin，Rif）、MS培养基粉末、蔗糖、琼脂粉，无水乙醇和GUS染色试剂等。其中GUS染色试剂购于盒华越洋生物技术公司，MS培养基粉末购于青岛高科技工业园海博生物技术公司。
1.1.3 培养基类型 菊花组织培养基：在MS[11]基本培养基上，添加30 gL1的蔗糖和6.5 gL1的琼脂以及不同6BA/NAA浓度配比的生长调节剂，并用1 M的NaOH或HCl将培养基的pH调至5.8，用高温高压灭菌锅在116 ℃条件下灭菌30 min。
①分化培养基：MS培养基+6BA+NAA（+Hyg/Km/Cb）（以叶盘为外植体）
②生根培养基：MS培养基+Hyg/Km（以茎段为外植体）
农杆菌培养基：YEB培养基，成分见附录B。
1.1.4 根癌农杆菌工程菌液 蘸取于保存于80℃超低温冰箱的菌液于YEB（含Rif 50 μgml1，Km 50 μgml1）平板上划线，将平板置于28℃恒温箱中倒置黑暗培养34 d。用镊子取黄色枪头蘸取3个单克隆后，置于YEB培养液中，28℃震荡培养过夜。再以1 %的接种量接种于YEB液体培养基，继续震荡培养至OD600=0.50.6。用50 mL离心管收集菌液，在27℃、5000 rpm条件下，离心8 min，下层沉淀即为农杆菌菌体。在下层沉淀中加入40 mL MS液体培养基，手动震荡至其溶解，即获得侵染菌液。

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