四跨膜蛋白（Tetraspanin, TET）是一类具有四个跨膜结构域、一个小的细胞外环和一个富含Cys的大细胞外环的跨膜受体糖蛋白。它是一类进化保守的细胞膜蛋白，广泛存在于不同物种中。植物TETs基因在植物叶片形态发生、根和花器官的形成、调节植物衰老以及防御病原微生物侵害等过程中起着重要的作用。但目前尚未有关于草莓TETs基因的研究报道，本研究中，我们对森林草莓TET基因家族进行了系统的研究，从森林草莓基因组中鉴定到11个TETs基因，进化分析表明森林草莓TETs基因与拟南芥、番茄等模式生物中的TETs基因高度同源，表达分析发现，森林草莓TETs基因具有较大的组织表达特异性，荧光定量PCR研究发现，森林草莓FvTET8的表达量在植物被灰霉病侵染后显著上调，我们进一步克隆了该基因，并构建了FvTET8的过量表达和基因编辑载体。研究结果为进一步研究FvTET8的基因功能验证奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 数据检索 3
1.2.2 森林草莓TET基因家族的鉴定和蛋白分析3
1.2.3 森林草莓TET基因家族的组织表达分析3
1.2.4 灰霉病接种森林草莓和病菌处理过的森林草莓总RNA提取与反转录 4
1.2.5 FvTET8基因响应灰霉病侵染的荧光定量PCR分析4
1.2.6 FvTET8基因的克隆与植物转化载体构建4
2 结果与分析 5
2．1 森林草莓TET基因家族的鉴定和蛋白分析5
2．2 森林草莓TET基因家族的基因结构与进化分析5
2．3森林草莓TETs基因在各个组织中的表达分析6
2．4 森林草莓TETs基因响应灰霉病侵染的表达分析7
2．5 FvTET8基因的克隆与植物转化载体构建8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
森林草莓TET基因家族的鉴定与表达分析以及FvTET8基因的克 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
隆
引言
引言
植物在生长过程中经常会遭受各种病害的攻击，为了生存，在漫长的进化过程中植物也相应地进化出了复杂的防御机制来抵抗各种病害的入侵。最近的研究发现，当遭受灰霉菌侵染后，植物除了合成抗病蛋白和次生代谢产物来抑制或杀死灰霉菌外，植物还可以将特定的小RNA（micro RNA, miRNA）通过外泌体转移到灰霉菌体内，以RNA干扰的方式抑制灰霉菌致病基因的表达，降低灰霉菌的致病能力或生长速度，从而起到防御作用[1]。
外泌体是由细胞分泌的直径在30～100 nm之间的微小囊泡状结构，内含有与其来源细胞相类似的细胞蛋白质、脂质、编码或非编码RNA等生物活性物质[2]。目前，外泌体的研究在动物中展开较多，研究发现，外泌体可以在细胞间来回转运具有生物活性的分子，例如膜转运受体、mRNAs、miRNAs和一些信号分子等。此外也有研究表明，外泌体可以与其它细胞进行质膜融合，从而将外泌体内的物质释放进入靶细胞[3]。它通过将细胞内蛋白质、RNAs 和脂质从一个细胞转运到另一个细胞，在细胞间起到稳定的细胞通讯的作用，外泌体还被发现具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能。在动物中，外泌体可通过改变基因调控网络或表观遗传重组来调控正常的生理过程[4]。动物中的研究发现，不同细胞来源的外泌体所包含的物质存在一定的差异，但位于囊泡表面的某些蛋白质可以作为外泌体的标记蛋白，如CD63和CD81[5]。
CD63和CD81均属于四次跨膜蛋白超家族成员（Tetraspanin, TET）。TETs是一组相对分子质量为25~50 KDa的跨膜受体糖蛋白，它们是一类独特的保守整合蛋白，具有四个跨膜结构域，一个小的细胞外环和一个富含Cys的大细胞外环，这对于彼此相互作用以及与其他蛋白形成参与形态发生，运动和融合过程中的细胞间通讯过程至关重要[3]。TETs系四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily,TM4SF)的重要成员，是一大类进化保守的细胞膜蛋白，广泛表达于不同物种中[9]。Maecker于1997年首次提出“分子促进子”(molecular facilitators)的概念，解释四跨膜蛋白特殊的四次跨膜结构能联系膜内、跨膜和膜外蛋白，起到连接膜内外信号的通道功能，并促进四跨膜蛋白信号网络中结合蛋白质的相互作用。四跨膜蛋白参与了包括与细胞生长、迁移、信号转导和黏附效应等多种生命活动。在高等脊椎动物中，发现其参与了病原体的识别与进入、癌细胞的迁移以及免疫系统中细胞与细胞间的相互作用等重要生物免疫反应过程[6]。四次跨膜蛋白分子表达异常与许多疾病的发生、发展密切相关[7]。例如丙肝病毒、艾滋病毒等许多病毒感染过程中四跨膜蛋白分子也发挥着重要的作用[8]。通过大规模基因组测序，人们也在无脊椎动物中发现了大量四跨膜蛋白家族成员，但研究范围局限于果蝇和线虫等模式生物。它们在分子内部或与其它蛋白相互作用,对各种基本的细胞生理过程进行调控,如细胞分化、细胞移行、同型勃附、细胞凝集、细胞溶解和信号转导等[7]。
与动物不同，目前在植物中TETs的研究较少，大部分植物TETs的生物学功能尚不清楚。不过对四跨膜蛋白的几种植物基因组的调查显示，它们普遍存在于多细胞植物物种中[910]。现有的实验表明，腐蚀植物的真菌(如灰霉病)在进入宿主组织，需要四跨膜蛋白分子在植物体表形成穿透小孔[11]。在拟南芥中，已知四跨膜蛋白在重要的植物发育过程中起作用，例如叶片形态发生，根和花器官的形成。Boavida等人发现四跨膜蛋白参与拟南芥的生殖发育[12]，他们用酵母中的分裂泛素测定表明，拟南芥四跨膜蛋白家族的几个成员以同聚体或异聚体紧密结合，这可以解释由于这些蛋白质之间分子相互作用的动态性和多样性而导致的功能冗余。Wang等人也在之后进行了更详细的研究，主张四跨膜蛋白在拟南芥发育的不同方面的作用[13]，并进一步提出了转录因子（TF）TET调节网络，用于预测各种植物途径中四跨膜蛋白的分子功能。同年，在Balaji Mani的研究中[14]，他们进行了水稻中四跨膜蛋白家族基因组的全基因组分析，鉴定到了水稻基因组中的四跨膜蛋白编码基因。并对水稻TET基因家族的表达模式进行了研究，研究发现，四跨膜蛋白的其中一些基因在衰老的早期会被诱导，表明它们在调节植物衰老中的作用。此外，他们也表示四跨膜蛋白可能起信号中继的作用，并参与多种生物过程的介导。上文提到的CD63属于哺乳动物的四跨膜蛋白，是外泌体特异的标志，在拟南芥中由研究人员发现了与其结构高度相似的TET8基因[15]。Cai等在2018年研究发现，拟南芥四次跨膜蛋白TET8在抗灰霉病过程中起重要作用，拟南芥TET8功能缺失突变体的灰霉病抗性显著降低[1]。

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