梨果实中有机酸的组分与含量是果实品质风味的重要组成因素，并对细胞代谢过程有影响。而对于大多数梨果实来说，苹果酸是最主要的有机酸。与苹果酸代谢相关的酶包括催化苹果酸合成的延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶（胞质MDH、线粒体MDH）、氧化代谢苹果酸的苹果酸合酶、参与苹果酸跨液泡膜运输的液泡氢离子 ATP 酶（V-ATPase）和液泡无机焦磷酸酶（vVPp）。目前，与苹果酸代谢相关的酶及基因研究已取得一定进展，但尚未进行生物信息学分析或实验验证其功能。以‘丰水’梨为试材，本研究结合生物信息学分析从梨中鉴定得到5个与苹果酸代谢相关的基因包括1个细胞质NAD依赖型苹果酸脱氢酶基因（cyNAD-MDH），1个细胞质NADP依赖型苹果酸酶基因（cyNADP-ME），2个液泡H+-ATPase合酶基因（vVAtp1和vVAtp2）和1个液泡无机焦磷酸酶基因（vVPp），它们在‘丰水’梨的叶、花、种子、茎和果皮中的表达具有组织特异性，在果实发育过程中的基因表达模式也不尽相同。本研究进一步完善梨果实苹果酸合成代谢网络，并为提升梨果实品质提供基因资源。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 2
1 文献综述 2
1．1 苹果酸代谢相关酶 2
1．2 苹果酸的贮藏和运输 3
1．3 苹果酸代谢相关酶基因的研究 3
2 材料与方法 3
2．1 材料 3
2．2 候选基因的筛选 4
2．3 理化性质，亚细胞定位和蛋白质三维结构分析 4
2．4 系统进化树 4
2．5 基因克隆 4
2.5.1 RNA 的提取 4
2.5.2 RNA 的反转录 4
2.5.3 转化与测序 6
2．6 实时荧光定量 PCR 6
2．7 瞬时表达 7
2.7.1 序列扩增 7
2.7.2 过表达载体的构建 7
2.7.3 制备农杆菌菌液及侵染果实 7
2.7.4 苹果酸含量的测定 7
3  *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
结果与分析 7
3．1 梨 cyNADMDH 基因的鉴定 7
3．2 梨 cyNADPME 基因的鉴定 8
3．3 梨 cyNADPME 基因的鉴定 9
3．4 梨不同组织及果实发育中苹果酸代谢相关基因的表达模式 10
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 14
附录 16
附表1. 不同物种中 cyNADMDH 的理化性质 16
附表2. 不同物种中 cyNADME 的理化性质 17
附表3. 不同物种中 VAtp 的理化性质 18
附表4. 不同物种中 vPp 的理化性质 19
梨果实苹果酸代谢相关基因的挖掘及分析
引言
引言 梨起源于中国，我国作为世界上梨果树种植面积最大、产量最多的国家[1]，具有丰富的梨品种资源。在大多数梨果实中，苹果酸(MA)是最主要的有机酸[2]，在植物中也充当了传递碳素的媒介参与多种代谢过程，可作为果实生长发育过程中的关键指标性物质。苹果酸是可滴定酸，是果实产生酸口味的重要物质，即对果实风味有一定影响[3]。还可作为营养物质对人体产生积极影响，研究表明苹果酸可促进人体对药物的吸收、增强对钙元素的吸收能力[4]，可进一步开发其优良的保健功能。果实中苹果酸的含量是由其合成、降解和区域化分布来共同决定[5]，受其相关基因的表达调控。因此，挖掘并分析梨果实中苹果酸代谢相关基因对提高果实品质和营养风味而言十分重要。
在柠檬酸循环及乙醛酸途径中，催化苹果酸合成和氧化的酶有延胡索酸酶（fumarase, EC4.2.1.2）、苹果酸合酶（malate enzyme, ME）和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)，其中苹果酸脱氢酶是生物糖代谢的关键酶[10]。目前，已在苹果中筛选克隆出线粒体型、乙醛酸体型、叶绿体依赖的苹果酸脱氢酶基因，也已从梨中克隆得到线粒体NADMDH（mNADMDHs；NCBI登录号GU256770）和cyNADPME（NCBI登录号GU256768）[6,17]。然而，尚未进行生物信息学分析或实验验证其是否定位于细胞质中。
苹果酸的转运可通过特殊的苹果酸转运蛋白(AttDT)，或以阴离子形式通过位于液泡膜上的苹果酸通道[6]。液泡的 H+ATPase (VATPase; EC 3.6.1.3)和无机焦磷酸酶(vVPp; EC3.6.1.1)是代谢产物穿过液泡膜运输的重要转运蛋白，相关部分基因在梨中已被成功克隆，如 vVAtps（NCBI 登记号 no. AB189963.1 和AB189964.1）和 vVPp（NCBI 登记号 no. AB097115.1）[6]，但仍需进一步挖掘与分析。
围绕梨中苹果酸代谢相关基因的挖掘和分析这一核心科学问题，本研究采用生物信息学分析，挖掘出梨果中与苹果酸合成、分解与转运相关的基因；进一步通过构建瞬时表达载体，验证关键基因的功能；最后，分析其在不同组织部位及果实发育不同时期的表达模式。本研究可进一步完善梨果实苹果酸合成代谢网络，并为提升梨果实品质提供基因资源。
1 文献综述
1．1 苹果酸代谢相关酶
果实中苹果酸含量是由其合成、降解和区域化分布来共同决定的[5]。细胞通过苹果酸的合成和氧化反应使其行使作为还原力载体和碳素载体的功能。在柠檬酸循环及乙醛酸途径中，催化苹果酸合成和氧化的酶包括延胡索酸酶、苹果酸合酶和苹果酸脱氢酶[10]。其中，延胡索酸酶也存在于动物和酵母的细胞质中，主要位于线粒体中, 可催化延胡索酸进行可逆水合反应生成苹果酸，但尚未有实验发现此酶存在于植物细胞质中 [7]。苹果酸合酶(ME)参与乙醛酸循环过程，通过系列反应生成的苹果酸进入糖异生途径产生葡萄糖，由此导致了苹果酸的消耗，则乙醛酸循环中苹果酸合酶可以降低苹果酸的含量，而水果的酸度也会因此降低[8]。苹果酸脱氢酶（MDH）是生物糖代谢的关键酶，利用 NAD+ 或 NADP+ 作为辅助因子催化苹果酸和草酰乙酸之间的相互转化。MDH 主要参与氧化 TCA 循环（将苹果酸转化为草酰乙酸），但在标准热力学条件下不易形成草酰乙酸，该反应不易发生[1819]。已经提出该酶在细胞内可能具有其他功能[20]，如参与还原性 TCA 循环以防御氧化应激，通过代谢途径参与底物的运输，并且在厌氧条件下生长的大肠杆菌的 MDH 还参与了还原性 TCA 循环（将草酰乙酸转化为苹果酸），产生琥珀酸[21]。此外，草酰乙酸酯可与自由基结合，因此它还参与了抗氧化应激的保护[21]。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/yy/607224.html