果实软化常在果实采后贮藏期间发生，主要由细胞壁结构降解和成分变化造成。果胶对稳定细胞壁结构十分关键，而多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）是参与果胶裂解的关键酶，因此PG在果实软化过程中具有重要作用。目前已在多种植物中鉴定到了PG基因家族成员，然而梨的PG基因家族及其调控果实软化过程的关键基因尚不清楚。本研究在梨基因组中鉴定到了61个PG基因家族成员，并将其分为6个分支。在此基础上，通过对丰水梨5个不同贮藏时期的硬度、PG酶活性及基因表达情况进行关联性分析，筛选获得调控梨果实软化的关键基因PbrPG6，并通过基因沉默对其功能进行验证，为阐明梨果实软化机制提供了依据，也为梨果实采后品质的保持和货架期的延长提供了基因资源。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 梨PG基因家族的鉴定和分析 2
1.2.1 梨PG基因家族的鉴定 2
1.2.2 梨PG基因系统进化分析 3
1.2.3 梨PG蛋白生理生化分析 3
1.3 实验方法 3
1.3.1 果实硬度的测定 3
1.3.2 PG酶活性的测定 3
1.3.3 转录组测序 3
1.3.4 荧光定量PCR（qRTPCR） 3
1.3.5 病毒介导的基因沉默（VIGS） 4
1.4 数据分析 4
2 结果与分析 4
2.1 梨PG基因家族成员的鉴定及生物信息学分析 4
2.1.1 梨PG基因家族成员生理生化分析 4
2.1.2 梨PG基因分类及系统发育分析 5
2.2 梨PG基因家族调控果实软化关键基因的筛选及验证 5
2.2.1 丰水梨贮藏期间硬度及PG酶活性变化 5
2.2.2 丰水梨贮藏期间PG基因表达分析 6
2.2.3 关键基因PbrPG6的功能验证 7
3 讨论 8
3.1 梨PG基因家族成员鉴定及分析  *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: #351916072# 
8
3.2 梨PG基因家族调控果实软化的关键基因 8
4 结论 9
致谢 10
参考文献 10
附录 13
梨多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）调控采后果实软化的分子机制
引言
引言
果实采后贮藏过程中常发生果实软化、色泽转变、风味改变等现象，从而使其食用品质和耐贮性下降[13]。其中，果实软化主要由细胞壁的结构降解和成分变化造成，涉及多种细胞壁降解酶及其调控因子[1,4]。果胶是细胞壁初生壁和胞间层的主要组分，对细胞壁的结构稳定性起着关键性的作用，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）是参与果胶裂解的关键酶，因而在果实软化过程中具有重要作用[5]。
PG是水解酶的一种，属于糖苷水解酶家族28（glycosyl hydrolase family 28，GH28），并至少含有一个GH28结构域[6,7]。根据PG对果胶裂解方式的不同，可将其分为3类，分别为内切半乳糖醛酸酶（endoPG）、外切半乳糖醛酸酶（exoPG）和鼠李糖半乳糖醛酸酶（rhamnoPG，RG）[8,9]，具有果实成熟特异性的一般指endoPG[10]。此外，在植物和真菌PG中，通常存在4个保守结构域，分别为SPNTDG（结构域I）、GDDC（结构域II）、CGPGHGISIGSLG（结构域III）和RIK（结构域IV）[11]。植物PGs由多基因家族编码[12]，目前已经在多种植物中得到鉴定，包括拟南芥、水稻、番茄、苹果和桃等[1315]。在不同植物中，PG具有广泛且不同的作用，可参与调控器官脱落、果实成熟和衰老、花发育等生长发育过程[11]。虽然PG基因家族成员在植物的不同生长发育阶段及不同组织中表达，具有功能多样性，但其主要功能为参与果实成熟，并与果实软化密切相关[16]。PG能够催化果胶分子多聚α(1,4)聚半乳糖醛酸的裂解，使果胶降解，细胞壁结构解体，从而导致果实软化[17]，其作用已经在番茄、草莓、苹果、桃、香蕉等研究中得到了证实[16]。然而，目前仅有少量关于PG与梨果实软化的研究[18,19]，也并未对梨PG基因家族进行鉴定，仅通过观察个别PG基因在不同品种、不同时期和不同处理下的表达量变化情况进行探究，且未对相应基因的功能进行验证，具有一定的局限性。本课题鉴定了梨基因组中的PG基因家族成员，在此基础上对丰水梨5个不同贮藏时期的硬度、PG酶活性和基因表达情况开展相关性分析，筛选获得调控梨果实软化的关键基因，并利用病毒介导的基因沉默技术（VIGS）验证其功能。本课题为阐明梨果实软化机制提供了依据，也为梨果实采后品质的保持和货架期的延长提供了基因资源。
材料与方法
植物材料
实验所用梨果实采集自大学江浦园艺站梨园，树体生长健壮，长势较为一致。选取成熟期丰水梨果实作为实验材料，梨果的大小、色泽、外形尽量保证统一标准且表面无机械损伤。采摘当天即运回实验室并将其随机分组，用塑料袋包装后贮藏于25℃条件下。随后每隔6天进行一次取样和硬度测定，直到果实腐烂率超过20%，共取样5次，即采后0d、6d、12d、18d、24d。取样时将果皮削去，削取果皮下方同等深度的果肉并将其立即放入液氮中，分装后贮存于80℃条件下待用。
梨PG基因家族的鉴定和分析
梨PG基因家族的鉴定
分别从TAIR（http://www.arabidopsis.org/）[20]和桃基因组数据库（http://www.rosaceae.org/）[21]下载拟南芥和桃PG基因家族信息，并将两者的PG氨基酸序列作为查询序列，在梨基因组数据库（http://peargenome.njau.edu.cn/）[22]中进行BLASTP比对搜索。从Pfam数据库（http://pfam.sanger.ac.uk/）[23]下载PG结构域（PF00295）序列，利用HMMER3软件构建HMM文件并在本地梨蛋白数据库中进行HMM搜索。使用这两种方法初步获得候选基因，随后利用Pfam和SMART网站（http://smart.emblheidelberg.de/）[24]验证其保守结构域的存在。在PG的4个高度保守结构域中（SPNTDGI、GDDC、CGPGHGISIGSLG和RIK），缺少超过两个结构域的候选基因将被剔除。

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