番茄SlGRAS4基因是GRAS转录因子家族编码基因之一，通过qRT-PCR验证和生物信息学分析表明该基因具有热胁迫响应能力。为了进一步研究其在番茄耐热调控所发挥作用，本试验采用病毒诱导基因沉默技术，将番茄SlGRAS4基因特异性片段构建到TRV2表达载体中，侵染番茄幼苗植株叶片并获得转基因株系。通过对SlGRAS4沉默植株和TRV2对照植株进行高温胁迫处理，调查表型性状和测定相关生理指标，研究结果表明在高温胁迫下沉默植株相对于对照植株更容易萎蔫，电导率、叶绿素含量、Fv/Fm以及抗氧化酶活性均下降。说明了SlGRAS4基因参与了番茄耐热调控。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract. 4
Key words 4
1引言 4
2文献综述 5
2.1GRAS家族基因研究现状 5
2.1.1GRAS家族基因在植物生长发育中的作用 5
2.1.2家族基因在植物非生物胁迫中的作用 5
2.2病毒诱导的基因沉默技术优点 5
2.3番茄耐热性鉴定方法 6
2.3.1田间自然鉴定方法 6
2.3.2花粉生活力鉴定法 6
2.3.3生理生化指标测定法 6
3材料与方法 6
3.1试验材料 6
3.1.1植物材料和培养 6
3.1.2菌株与载体 6
3.1.3酶与生化试剂 6
3.1.4实验所需引物 7
3.2试验方法 7
3.2.1SlGRAS4 基因的qRTPCR验证 7
3.2.2SlGRAS4的克隆和生物信息学分析 7
3.2.3农杆菌介导的SlGRAS4遗传转化 7
3.2.4高温胁迫处理 8
3.2.5样品收集和指标测定 8
3.2.6数据处理 8
4结果与分析 8
4.1SlGRAS4响应高温胁迫的验证 8
4.2SIGRAS4的克隆和生物信息学分析 9
4.3沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄表型影响 11
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.4沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄生理指标影响 11
4.4.1沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄相对电导率影响 12
4.4.2沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄总叶绿素含量影响 12
4.4.3沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄Fv/Fm影响 13
4.4.4沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄H2O2含量影响 13
4.4.5沉默SlGRAS4在高温胁迫下对番茄抗氧化酶活性影响 13
5讨论 14
6结论 15
参考文献 16
致谢 17
VIGS介导番茄SlGRAS4转录因子的耐热功能验证
引言
番茄（Solanum lycopersicum L.）属于茄科番茄属‎[1]，作为重要的世界性经济作物，被广泛用于设施栽培和露地栽培。番茄喜温但不耐高温，高温对其种子萌发、营养生长、生殖生长都有不良影响。目前，随着全球气候变暖，高温愈来愈影响到植物的生长、发育和作物产量‎[2]，在我国南方地区，高温胁迫已成为番茄减产的一个主要原因。
园艺作物的生长发育受基因网络调控，转录水平的调控影响着真核生物基因表达。植物在响应非生物胁迫的过程中受到多种类型转录因子的调控‎[3]。所以对转录因子的研究尤为重要。目前，植物在响应高温胁迫转录因子的研究中，对于热激转录因子HSFs 的研究比较多也比较成熟。也有研究证明WRKY 转录因子‎[4]，NAC 类转录因子‎[5]，MYB 类转录因子‎[6]，bZIP 类转录因子‎[7]在对于植物响应高温胁迫时也具有调控功能。
GRAS转录因子是植物特有的转录因子，在多种植物中已有发现，如拟南芥、水稻、佛手、柑橘、番茄等‎[8]。该类转录因子的所有成员都具有特殊GRAS结构，国内外的研究证明，GRAS转录因子与植物的生长发育、信号传导和逆境胁迫等方面密切相关‎[9]。这些研究发现对GRAS转录因子家族在番茄耐热性方面的研究具有指导性作用。
实验室对40℃高温处理的醋栗番茄（LA2093）进行转录组测序，发现SlGRAS4的表达量增加。为了进一步确定SlGRAS4响应高温胁迫以及验证其在响应高温胁迫过程中的功能，本课题通过VIGS进一步证明SlGRAS4参与番茄耐热调控。
文献综述
GRAS家族基因研究现状
作为转录因子，GRAS家族是植物所特有的，在上个世纪九十年代受到广泛关注。最早发现的家族成员为GAI、GRA与SCR，故命名为GRAS（Bolle 2004）。其产物一般为400~700个氨基酸，并且拥有典型结构：PFYRE、ASW、七个亮氨酸重复域（LHRI）和七个亮氨酸重复II（LHRII）等（Hirsch等 2009）。
GRAS家族基因在植物生长发育中的作用
DELLA作为GRAS家族中分支蛋白，具有负调节GR信号通路的功能，使得植物生长发育受到抑制。该蛋白在很多植物中已有发现，如葡萄的VvGAI以及西红柿的LeGAI、玉米的D8、小麦的RhtB1/RhtD1、大麦的SLN1、水稻的SLR1、拟南芥的GAI等（Vandenbussche等 2007; Aleman等2008; Dai和Xue 2010）。GA信号通路调节植物生长发育的原理是降解DELLA蛋白，如果DELLA结构域产生变异，受GA诱导的 DELLA蛋白降解就会受阻，这时植株表现成不敏感GA的矮化表型(Fu等 2004)。因为根系的发育也受到GA信号通路的调控，由此说明DELLA蛋白在在根系发育中发挥作用。
Li等（2003）研究发现，水稻中属于GRAS家族核蛋白的一个基因—MONOCULM 1在叶芽的发育中也发挥作用，具有调节叶芽形成和生长的功能。Schumacher等（1999）在番茄中发现了GRAS同源基因Ls具有与MONOCULM 1类似的作用；Greb（2003）也在拟南芥中发现GRAS同源基因AtLAS/SCL18基因同样与腋芽的生长发育相关。
GRAS基因家族影响光敏色素信号通路。为了适应多变的环境，植物通过光敏色素感受器感受光信号的变化。GRAS蛋白家族中有一个蛋白名为SCL13，这个蛋白可以调控光敏色素phyA的信号转导（TorresGalea等 2006）。Bolle等（2000）又发现GRAS蛋白家族中的一个蛋白分支—PAT1可以作为早期的一个信号参与phyA的信号转导。

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