梨果树原产于中国，产量是我国排名第三的果树，仅排在苹果和柑橘之后，具有重要的社会经济和观赏价值。梨果实外观品质是影响市场价值的重要因素，红皮梨因其独特而艳丽的外观广受消费者青睐，具有较高的市场价值。梨果皮呈红色是花青苷积累的结果，本项目基于西洋梨‘早红考密斯’及其绿色芽变品种的转录组测序结果，筛选出3个在红绿果皮组织中差异表达且表达量与果实发育过程中花青苷含量正相关的NAC转录因子（PyNAC100、PyNAC4、PyNAC72）。成功将它们的ORF框重组到瞬时表达载体pSAK277上，构建了NAC转录因子的过表达载体。使用农杆菌介导法将过表达载体转化至烟草叶片和‘早酥’梨果皮中。通过表型观察、花青苷含量的测定、花青苷结构基因和转录因子在过表达组织中的表达水平检测，鉴定了NAC转录因子在梨果皮花青苷合成过程中的功能。通过试验希望挖掘到花青苷合成相关的重要功能基因，为梨外观品质的遗传改良提供优质基因资源。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言3
1 材料与方法4
1.1 试验材料4
1.1.1 梨果皮的采集4
1.1.2 侵染材料的培养和采集5
1.1.3 载体、菌株和试剂5
1.2 试验方法5
1.2.1花青苷合成相关转录因子的筛选与克隆5
1.2.2 NAC瞬时过表达载体的构建6
1.2.3 NAC瞬时过表达载体的农杆菌转化与鉴定7
1.2.4 农杆菌介导的NAC转录因子瞬时转化烟草和梨果实8
1.2.5 花青苷的提取和含量测定8
1.2.6 RTqPCR基因表达量分析8
2 结果与分析10
2.1 基因克隆与瞬时过表达载体的构建10
2.2 瞬时过表达载体的农杆菌转化与鉴定12
2.3 NAC转录因子瞬时转化烟草和梨后的表型分析12
2.4 梨果皮花青苷含量的测定及差异显著性分析13
2.5 RNA的提取与质量检测14
2.6 NAC过表达组织中花青苷合成相关基因的表达模式分析14
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/> 3 讨论15
致谢16
参考文献17
PyNAC在梨果实花青苷合成过程中的功能研究
引言
梨是蔷薇科（Rosaceae）梨属（Pyrus L.）植物。梨原产我国，有很高的环境适应能力，世界上很多地方都有梨树的栽植。我国梨树种植的面积和产量均在世界第一。然而在国际市场的竞争力较弱，这看起来与前文“梨树大国”的说法有些矛盾。究其原因主要是我国的梨果实外观品质较差，品种单一，难以满足国际化市场的需求。
我国梨属种质资源根据不同性状有多种分类方法，不同种的果皮颜色差别也很大，据此可分为三种类型。它们分别是绿色果皮（包括黄色和介于黄绿之间的颜色）、褐色果皮（包括其他颜色偏褐色）和红色果皮（包括整个果皮和部分果皮呈红色）。红皮梨的果皮色彩艳丽又引人注意，所以育种工作人员和消费者都非常喜爱，在市场销售中也广受欢迎。此外，花青苷作为果皮呈红色的主要原因，对人体健康也很有好处。比如经常作为可抗衰老的营养成分添加到不同的食品中。就此来看，红皮梨的市场发展前景广阔[1]。甚至可以扩展到旅游业，或与二三产业结合，使之更加符合当今社会人们对于更高品质生活的追求。但我们不难发现，现在的市场上所销售的梨品种主要还是以绿皮和褐皮为主，红皮品种较为少见，这种现状更加促使优质红皮梨的选育成为未来梨新品种选育的主要目标。
目前，梨果皮色泽正逐渐成为研究热点，除了花青苷结构基因的研究外[2,3]（Sun., 2016; Zhang., 2015）,与花青苷生物合成相关的复合体（如MYBbHLHWD40和MYBbHLHERF）也有报道[4,5]（Yao et al., 2017; Cui., 2013）。近年来，分子生物学研究迅速推进，接着又有梨基因组的测序完成[6]（Wu et al., 2013）。这些都为研究人员提供了更有说服力和更有帮助的理论基础来揭开梨花青苷合成调控机制的奥秘。目前，除了梨之外，在一些模式植物和其他园艺作物中，与花青苷合成相关的研究也在更进一步。科学家们在花青苷结构基因和转录因子方面的高度探索也从未停止。Fischer等[7]和 Halbwirth等[8]于红梨中提取出FHT、DFR和ANS三种花青苷合成基因。李俊才等[9]从‘红巴梨’中克隆了UFGT基因等。这些研究的相同点是，目的基因基本上都是结构基因，涉及调控它们的转录因子的研究相对较少也比较初步，其作用机制尚不清楚。在这些为数不多的研究中，PyMYB10是研究人员已经分离并鉴定的重要的花青苷调控基因，其促进梨果皮花青苷合成的作用也得到了验证[10]。除了MYB家族外，NAC、WRKY等转录因子家族在调控植物次生代谢方面也存在着更多的可能，相关研究还有待进一步深入。
进入21世纪以来，有关转录因子的研究日益增多，这中间NAC转录因子是科学家们发现的一种重要的转录因子，主要在植物中起作用。NAC转录因子可以调节植物的生长发育[11]（Olsen et al., 2005），在植物们受到来自别处的非生物胁迫时予以保护。就现在的研究看，许多常见植物中都被发现包含着很多NAC基因，如模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草，农业作物小麦、水稻和园艺作物桃等。越来越多的试验证实，NAC转录因子在植物生长发育的每个阶段都作用匪浅[12]。另外，它们还可以调控次生代谢物质的累积。近几年科学家最新研究得出，红肉桃中的PpNAC1基因能够激活PpMYB10.1的表达，以此推动果肉中花青苷的累积[13]（Zhou et al., 2015）。苹果中也被检测到MdNAC029基因能够激活MdMYB1的转录，在愈伤组织中产生促进花青苷合成的作用[14]（An et al., 2018）。花青苷相关基因的功能研究有利于全面了解果皮色泽是如何形成的。此外对在分子水平上分析色泽相关的育种研究也起到促进作用。
本项目依托于大学梨工程中心。试验基于西洋梨‘早红考密斯’和绿色芽变品种的转录组测序结果，利用梨基因组平台、梨中心建立或优化的花青苷液相检测体系和瞬时遗传转化体系，对3个NAC转录因子进行功能鉴定，以期挖掘到调控花青素合成的重要功能基因，为开展色泽性状的遗传改良提供优质候选基因资源。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 梨果皮的采集

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/yy/607183.html