目录
摘要 III
关键词 III
ABSTRUCT IV
KEY WORDS IV
引言 1
1 材料与方法 4
1.1 主要材料 4
1.1.2病毒、血清和细胞 4
1.1.3载体和表达菌株 4
1.1.4配置的试剂 4
1.2 方法 4
1.2.1 RNA提取和cDNA合成 4
1.2.2 引物设计 5
1.2.3 S1基因的扩增 5
1.2.4 PCR产物的回收 6
1.2.5重组表达质粒的构建 6
1.2.6重组表达质粒的抽提与鉴定 7
1.2.7 S1蛋白的小量诱导及SDSPAGE电泳鉴定 8
1.2.8 S1蛋白表达诱导条件优化 9
1.2.9 S1蛋白的大量表达和表达形式鉴定 9
1.2.10 目的蛋白纯化及复性 9
1.2.11 重组S1蛋白的Westernblot鉴定 10
1.2.12 动物免疫 10
1.2.13 骨髓瘤细胞的复苏和传代 10
1.2.14 饲养细胞的制备 11
1.2.15 脾细胞的采集和细胞融合 11
1.2.16 阳性杂交瘤细胞株的筛选 11
1.2.17 阳性杂交瘤细胞的克隆培养 12
1.2.18 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）检测 12
2 结果与分析 13
2.1 S1基因的扩增 13
2.2 重组表达载体的双酶切鉴定结果 13
2.3重组质粒测序 13
2.4阳性表达菌株的PCR鉴定 14
2.5 重组S1蛋白的SDSPAGE鉴定 14
2.6 重组S1蛋白的最佳诱导条件 15
2.7 重组蛋白表达形式的鉴定 16
2.8重组S1蛋白的纯化和复性 16
2.9 重组S1蛋白的Westernblot分析 17
2.10 小鼠血清效价检测 17 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 

2.11 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）检测结果 18
3 讨论 18
致谢 19
参考文献 20
猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备
摘要
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为特征的高度接触性肠道传染病。PED最早于1971年发现于英国，此后包括中国在内的多个国家也报道了该病的发生，给各国养猪业带来了严重的损失。本研究以原核表达的重组S1蛋白作为抗原，通过杂交瘤技术成功制备了抗S1蛋白的单克隆抗体。具体研究内容如下：
1、猪流行性腹泻病毒重组S1蛋白的原核表达：
根据Genbank公布的PEDV S基因序列设计一对特异性引物，从一株已知猪流行性腹泻病毒中扩增S1基因，再将S1基因克隆到原核表达载体pET28a中，得到的28aS1重组质粒转化入BL21（DE3）菌株进行IPTG诱导表达，得到的表达产物经SDSPAGE鉴定为大小约40KDa的重组S1蛋白，经纯化后进行Westernblot鉴定，证明有良好的反应原性。
2、抗S1蛋白单克隆抗体的制备和鉴定：
将原核表达的重组S1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠，得到的杂交瘤细胞经筛选，并经有限稀释法克隆后获得一株能稳定分泌S1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，间接免疫荧光结果显示其分泌的单克隆抗体能与PEDV特异性结合。
本研究制备了PEDV抗S1蛋白单克隆抗体，为PEDV实验室诊断技术的建立奠定了基础。

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