猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以呕吐、肠炎、腹泻及死亡为特征的猪传染性疾病。该病在世界范围内广泛流行，是造成仔猪早期死亡的重要疾病之一，研究PEDV的遗传进化演变对我国养殖业发展有重大意义。本研究对2018年9月到2019年1月华东地区（安徽、江苏、湖南）规模化猪场送检的临床样品进行PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（RV）病原学检测。结果显示，PEDV、RV和TGEV的阳性率分别为28.5 %、10.5 %和12.8 %。为明确现阶段我国上述3地区PEDV毒株的流行情况，主要针对S和ORF3基因进行遗传变异分析。通过对5株阳性病料S和ORF3基因序列和2株病料的全基因克隆、测序，并与国内外已报道的毒株基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明，在华东地区存在的部分PEDV野毒株为流行毒株，主要与我国2010年以后分离的毒株同源性较高，与经典毒株CV777及2006年我国分离的LZC毒株的同源性较小。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言2
1.1 猪流行性腹泻病毒研究进展2
1.2研究的目的及意义 4
2 材料与方法4
3 结果与分析7
3.1 PEDV、TGEV和RV病原核酸检测结果7
3.2 PEDVS及ORF3基因扩增结果8
3.3 PEDVS及ORF3序列结果分析9
3.4 全基因组序列扩增结果及遗传进化分析15
3.5 PEDV全基因组序列分析16
4 讨论17
致谢18
参考文献18
华东地区猪流行性腹泻病毒的检测及遗传分析
引言
1 引言
1.1猪流行性腹泻病毒研究进展
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是一个由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
）引起的一种猪以呕吐、脱水、肠炎、腹泻和死亡为特征的传染病。猪在各年龄段都会受到感染，哺乳仔猪尤为易感，病死率接近100 %[1]。到目前为止，PED是给我国猪场带来重大损失的疾病之一，在我国全国范围内大范围流行，至今没有该病的特效药。PEDV病毒易突变，传播途径多样，使我国目前无法有效控制PED，本文通过对PEDV部分毒株进行分子流行病学分析，为今后对PEDV的防控提供一定的参考作用。
1.1.1 PED的病原学 PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus），其基因组类型为单股正链RNA，全长大致28 kb，其颗粒结构和同属冠状病毒科其他成员相似，大多为球形，直径为95~190 nm，有囊膜、并且具有感染性，囊膜上有花瓣形状的纤突，长度在18~23nm之间，呈放射状。PEDV基因组由三部分组成，分别为5’非编码区、3’非编码区和6个开放阅读框，主要编码ORF1，S，ORF3，sM，M，N等蛋白[2]。
ORF1基因主要编码多聚蛋白lab(pplab)，参与病毒RNA的复制[3]。S基因可编码纤突蛋白，这种蛋白在识别受体，诱导抗体产生，引导病毒与受体细胞膜融合中起到了重要作用[4]。ORF3是PEDV的辅助基因，主要编码离子通道蛋白，现在研究多认为其与病毒的毒力强弱有关，在该病的流行性调查中有重要意义[5]。sM基因编码小膜蛋白（E），合成病毒的囊膜和病毒粒子[6]。M基因主要编码蛋白完成病毒出芽和病毒粒子装配这两个过程[7]。N基因编码一种能成为螺旋核衣壳的基础结构的RNA结合蛋白[8]。
1.1.2 PEDV的流行病学 PED于1971年首次在英国被发现诊断并报导，如今已广泛流行在世界各个养猪国家，强度和范围有不断提升和扩大，PEDV已经成为给全世界的养猪业带来巨大的经济损失的重要因素之一。
PED任何时间可发生，多发于冬、春两季，其他季节发病率较低但仍会发病。任何品种、日龄和性别的猪包括野猪均可被PEDV感染。PEDV主要传播途径为消化道和呼吸道。发病猪和潜伏期的猪将粪便排泄到外界，污染饮水、饲料及环境，未感染的猪在接触这类污染的饲料和饮用污染的水后会被感染。此外，污染运输车辆、靴鞋也可造成PEDV的传播。研究发现病愈后的猪也会排毒，是一大危险的潜在传染源[9]。陈建飞等研究[10]发现了PEDV存在于哺乳患病仔猪的母乳中，提示了PEDV可能通过母猪垂直传播给哺乳仔猪。
20世纪80年代以来，我国就陆续报道称有地区猪群爆发类猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）疫情。由于发病猪的临床症状与TGE极其类似，仅从发病症状和病变上很难区分。直到1984年才正式确诊为PEDV感染。此后PEDV便在中国各个省和自治区迅速传播，包括江西、浙江、安徽、湖南、江苏、青海等地。我国早在1995年就研制出弱毒苗或二联灭活疫苗对PEDV和TGEV进行联合预防[11]。但由于同种疫苗的不断使用和操作的不规范导致疫苗对PEDV的预防效果越来越差，自2006年以来，猪群虽进行了疫苗的免疫接种但PEDV的流行仍不断发生[12]。我国从2010年开始部分地区爆发PED疫病流行，此疫情中初生仔猪患病后的死亡率高达90%[13]，给养猪业带来了重大损失。基于当时市场上的疫苗无法起到保护作用，研究人员认为PEDV发生了变异。从施标等通过分子流行病学研究对同时期国内分离的11株病毒进行遗传进化分析[14]，基本确定了造成这次PED爆发的PEDV毒株拥有了新的基因型，与经典疫苗株CV777相差很大。因此从分子流行病学上加强对PEDV毒株监测，优化防控方法，在降低养猪业的经济损失上有着积极的意义。
1.1.3 PED常用检测方法 由于猪感染PEDV的临床症状和病理变化和感染其他腹泻病毒变化十分相似，因此无法通过肉眼可见的临床病理变化来诊断，需要用实验室检测方法进行确诊。实验室诊断中的免疫电镜观察、中和试验、免疫荧光技术及病毒分离培养等方法因为操作繁琐、耗时长，不适合用于PEDV快速诊断。随着诊断技术的发展，直接免疫荧光法（FAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和各种反转录聚合酶链式反应（RTPCR）等技术成为了目前检测PEDV的主要方法。

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