猪瘟是一种高度接触性烈性传染病，牛病毒性腹泻病是一种呈全球分布的接触性传染病。CSFV和BVDV都含有Npro非结构蛋白，此蛋白可影响干扰素的产生，从而帮助病原逃避宿主的天然免疫，建立持续性感染。本实验通过设计引物，使用RT-PCR的方法，成功扩增出目的基因Npro。使用对应的限制性内切酶分别对CSFV和BVDV-1的Npro基因进行双酶切，回收后，与用相同的限制性内切酶切割pEGFP-N1载体进行连接、转化，成功构建真核表达载体。利用菌液PCR筛选阳性克隆，双酶切及测序验证重组质粒的正确性。用脂质体转染法，成功将质粒瞬时转染至293T细胞中，在荧光显微镜下观察到荧光；通过Western blot检测，成功表达了两病原的重组蛋白Npro，为研究蛋白功能奠定了基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与仪器 4
1．1 实验材料 4
1．1．1 样品、细胞 4
1．1．2 主要试剂 4
1．2 实验仪器 4
2 实验方法 5
2．1 技术路线 5
2．2 引物的设计 6
2．3 RTPCR扩增Npro基因 6
2．3．1 RNA的提取 6
2．3．2 cDNA的合成 6
2．3．3 PCR扩增 6
2．4 PCR产物的电泳与回收纯化 6
2．4．1 核酸凝胶的制备与电泳 6
2．4．2 PCR产物的回收纯化 7
2．5 真核表达载体pEGFP1Npro的构建 7
2．5．1 Npro基因与pEGFP1载体双酶切 7
2．5．2 Npro基因与其pEGFP1载体的连接 7
2．5．3 重组质粒的转化 8
2．5．4 阳性菌的筛选与培养 8
2．5．5 阳性重组质粒的提取 8
2．5．6 阳性重组质粒的酶切鉴定 8
2．6 转染重组质粒 9
2．6．1 细胞的 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
培养与准备 9
2．6．2 转染重组质粒 9
2．7 荧光鉴定 9
2．8 Western blot鉴定 9
3．1 CSFV和BVDV1的Npro基因的扩增 10
3．2 CSFV和BVDV1的Npro基因与pEGFP1质粒的双酶切 10
3．3 真核表达质粒的构建 10
3．1．1 阳性菌的筛选 10
3．1．2 阳性重组质粒的酶切鉴定 11
3．4 荧光鉴定 11
3．5 Western blot鉴定 12
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 14
猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒Npro蛋白的克隆及特性研究
引言
引言
猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属，是有囊膜的正链RNA病毒。会引起猪的急性、高度致死率的传染病，严重危害我国的养殖业的生产发展[12]。
CSFV基因组编码一个较大的多聚蛋白（由3898个氨基酸残基组成），此多聚蛋白经过病毒和宿主细胞的酶作用，可形成４个成熟的结构蛋白（包括C、E0、E1、E2）；其余为非结构蛋白（包括NPro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。
目前CSFV与其宿主相互作用的机制仍有待研究，特别是对细胞的调控上。病毒在细胞内的复制和增殖需要病毒蛋白、病毒核酸和宿主蛋白的共同参与。国内外对CSFV的分子生物学研究主要集中在E2和E0基因上，对NPro基因研究并不多，而有研究表明Npro基因对宿主的天然免疫系统也有一定影响，它帮助了CSFV逃避宿主机体的天然免疫，帮助建立持续性感染[4]。
本实验通过将NPro基因连接真核表达载体上，构建重组真核表达质粒，并利用脂质体转染方法转染细胞。再通过Western blot检测重组蛋白，进一步确定蛋白特性。该实验为该蛋白的功能研究提供一定的依据[5]。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)同是黄病毒科的病毒，与CSFV不但具有相似的结构，而且在血清学上也有交叉反应[6]。牛病毒性腹泻（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）所致牛、鹿、猪等动物的一种接触性传染病，呈世界性流行趋势，该病主要以腹泻、发热、急慢性黏膜感染、繁殖障碍等为主要特征，对全球畜牧业危害严重，是国际贸易中动物检疫的重要疫病之一。该病在我国普遍存在，给养牛业造成巨大的经济损失，控制和消除该病显得尤为重要[78]。
作为正股RNA的BVDV只包含一个开放阅读框(ORF)，编码有7或者8种非结构蛋白，从N端开始至C末端依次为NPro、p7、NS23域者NS2和NS3)、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中NPro蛋白，又称p20或前导蛋白酶，是所有瘟病毒属成员的ORF编码的第一个蛋白，由164个氨基酸残基组成，是一种具有蛋白水解酶活性的半脱氨酸蛋白酶[9]。BVDV的非结构蛋白NPro被证明在在抗病毒反应中发挥着重要作用，可以协助病毒逃逸宿主的先天免疫反应[10]。
目前在国内，BVDV感染主要以持续感染和免疫耐受等隐性感染为主，因此BVDV的防控重点在于检测出这种隐性感染动物。BVDV的研究在国外较为热门，研究进展速度也较快，而在国内，BVDV的研究仍处于起步阶段，加上BVDV抗原的复杂性，极大地限制了人们对BVDV的研究[11]。
基于非结构蛋白NPro在BVDV病原学上的重要功能和致病性，本研究通过对BVDV1结构蛋白的编码基因进行克隆，旨在对BVDV1病原性作一定探索,在细胞水平上初步研究BVDV1非结构蛋白Npro的生物学特性，为深入研究该蛋白对致病性的分子机制奠定了基础。了解BVDV1蛋白功能，也有助于发现控制BVD传播的新方法,为该病的防控提供参考，为BVDV的预警和防控提供一定理论基础[1213]。
1 材料与仪器

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