目录
摘要1
关键词1
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法5
1.1实验动物 5
1.2实验日粮 5
1.3饲养管理6
1.4样品采集6
1.5主要仪器试剂6
1.6 pH测定6
1.7瘤胃SCFA测定6
1.8 RT qPCR7
1.8.1瘤胃上皮总RNA的提取7
1.8.2RNA的质量检测7
1.8.3 反转录7
1.8.4设计引物8
1.8.5 Real time qPCR的产物检验8
1.8.6 Real time qPCR扩增体系8
2 结果与分析10
2.1 日粮精料水平对瘤胃液pH与SCFA浓度的影响10
2.2 日粮精料水平对mRNA表达的影响11
3讨论 13
参考文献14
致谢15
表11 日粮组成5
表12日粮化学成分5
表13 RT q PCR序列9
表14 瘤胃SCFA浓度10
图21 日粮精料水平对羊瘤胃液pH影响10
图22 qPCR表达的结果11
a SCFA受体相关基因11
b 复合体相关基因11
c 免疫相关基因11湖羊瘤胃增殖和屏障功能对高精日粮的适应
摘要
反刍动物瘤胃微生物发酵产生短链脂肪酸（SCFA），其为反刍动物最主要的能量来源之一，可提供机体所需的大部分能量；SCFA 更是调节生命活动的信号因子。研究表明日粮精料水平影响瘤胃上皮的生长。本研究拟通过渐进式增加二种不同比例精料的日粮将湖羊分为二组饲喂。12头湖羊，适应期饲喂10%精料+90%粗料的全混合日粮。适应期后随机分为高精组和对照组，每组6头，其中高精组6头装有永久瘘管。实验期间，对照组全程10%精料+90%粗料的全混合日粮饲喂，高精组按每周增加20%精料的方式将日粮精料从10%上升为70%。实验开始后的第29天屠 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
宰。屠宰前一天进行24小时瘤胃pH监测，屠宰时采集瘤胃的腹囊后端上皮及瘤胃液样本。饲喂结束后收集湖羊瘤胃液测定瘤胃pH和SCFA浓度。采集瘤胃上皮，测定SCFA吸收相关基因的mRNA表达量。通过各组间数据比较，判断湖羊瘤胃对渐进增加精料饲喂的吸收适应性，实验结果显示，渐进式的高精日粮明显促进了瘤胃上皮的生长，使其保持了健康状态，这对反刍动物的生产性能具有重大意义。
引言
引言
反刍动物在我国的畜牧行业中占有十分重要的地位，因此反刍动物的健康就显得十分重要，所以对于反刍动物生活的环境、给予的饲料就要更加慎重。反刍动物具有独特的消化系统，即为瘤网瓣皱，这些器官是反刍动物消化、代谢、营养吸收最重要的器官。[2]而前胃上皮则显得更加重要，因为许多重要的结构蛋白都存在于上皮上，这些结构蛋白对于维持反刍动物正常的生理功能具有重要的意义。[9]
由于反刍动物需要营养以达到生产性能的需求，饲喂反刍动物的饲料中高精日粮的比例就在不断攀升，然而当反刍动物摄入高精料的日粮时，瘤胃微生物就会发生作用，短时间内就会在瘤胃产生大量代谢产物，此时瘤胃内大量的蛋白和碳水化合物发酵，同时瘤胃内有害产物也会大量积累；可能导致瘤胃上皮的损坏、以及屏障功能和细胞增殖功能的破坏。大量的易发酵碳水化合物的产生使得瘤胃中的微生物发酵加快产生短链脂肪酸（Shortchain fatty acids, SCFA，pKa≤4.8）的速度，当瘤胃SCFAs等有机酸的产生量超过吸收和缓冲能力，将导致瘤胃pH下降，瘤胃缓冲体系弱化，改变瘤胃环境引起消化吸收功能紊乱、损伤瘤胃屏障，严重的会引起亚急性瘤胃酸中（Subacute ruminal acidosis, SARA），使反刍动物的健康受到影响，进而影响生产性能。[1,3]
SCFA是瘤胃微生物发酵饲料的主要终产物。瘤胃内总SCFA含量及其中各酸的比例会随着采食量与日粮组成（特别是其中的可发酵有机物）的变化而改变（Yang et al., 2012），正常浓度约为60150mM。SCFA不仅影响瘤胃pH、为宿主提供能量，它还是关系反刍动物功能和健康的关键因素。瘤胃的腔面覆盖着由角质层、颗粒层、棘突层和基底层构成的复层上皮，其主要功能是吸收和转运营养物质、代谢和防御。SCFA对上皮细胞增殖、上皮完整性和防御功能、上皮运输等都有显著影响。[1]升高SCFA浓度可引起瘤胃上皮转运蛋白（Lu et al., 2015）、酶蛋白（Oba et al., 2015）、连接蛋白（Liu et al., 2013）和调节蛋白（Steele et al., 2012）等多种功能蛋白表达的改变。瘤胃SCFA浓度从110mM升高到140mM，引起上皮钠/氢交换蛋白NHE1和NHE3表达的增加（Yang et al., 2012），以维持上皮细胞内pH的稳定和正常的生理功能。提高SCFA浓度还引起DRA（downregulatedinadenoma）表达增加（Connor et al., 2010.），催化细胞外与细胞内的SCFA/HCO3交换，将反刍动物所需的能量物质转运进细胞，而将缓冲物质转运到瘤胃腔，避免瘤胃pH降低而引发酸中毒（Aschenbach et al., 2011）。SCFA浓显著影度变化还响单羧酸转运蛋白(MCT)和钠/钾ATP酶泵(Na+/K+ATPase)的表达水平。另一方面，研究表明，MCT4对SCFA的转运能力相对较弱，那么高精度日粮的饲喂所导致的MCT4表达的下降可能是瘤胃上皮摄取SCFA的一种平衡反应。上述研究一方面显示了瘤胃上皮对瘤胃SCFA浓度的适应,从而在瘤胃SCFA浓度不断变动的环境中维持上皮的正常功能；另一方面表明瘤胃SCFA作为调节因子对瘤胃上皮的功能以及功能蛋白的表达起重要的调节作用。[4,5,6]
胃肠上皮细胞具有紧密连接的结构，是一个具有选择透过性的动态的屏障，它能够阻止有害物质或病原体等潜在的危害进入机体里而影响健康，同时又能够允许机体摄入的营养物质、离子和水等进入体内。生物有机体的稳态依赖于生物合成和分解代谢的平衡，而上皮组织和瘤胃器官的功能则依赖于瘤胃上皮细胞的增殖和分化以及细胞的死亡所达成的细胞数量的的稳态。而在反刍动物的瘤胃上皮中，颗粒层的紧密连接，其次还有桥粒连接和间隙连接等细胞连接，它们共同发生作用，保证瘤胃上皮的完整性和动态的选择透过性，起到了结构性的屏障作用，因此对于反刍动物十分重要。目前对反刍动物瘤胃上皮细胞中的结构，例如连接等的研究才刚刚起步，大部分仍然是研究细胞连接蛋白在瘤胃上皮的分布上，研究各种细胞连接的功能还不够透彻和完全；目前仅见紧密连接蛋claudin1、claudin4、claudin7、ZO1和occludin的定位和少数蛋白组学研究，，有些研究也表明上述基因的表达受到饲粮营养水平和饲养制度的影响，通讯连接蛋白 Connxin43 研究较少，桥粒连接蛋白桥粒芯蛋白（desmoglein 1）和桥粒钙粘蛋白 DSG1 有少量研究。从研究现状看，对细胞连接蛋白调节的研究很少，尤其缺乏的事体内试验的数据，而这些蛋白又对瘤胃上皮的屏障功能十分重要，因此，研究瘤胃上皮细胞连接，[10,11]尤其是相关mRAN基因的表达情况，通过这些来判断精料变化对瘤胃上皮屏障功能的影响，对保护瘤胃正常生理功能，保障反刍动物的健康，提高反刍动物的生产性能具有重要意义。

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