奶牛乳腺炎主要是指发生在奶牛乳腺的各种炎症，为奶牛养殖业的健康发展带来了巨大危害，而金黄色葡萄球菌就是致病菌的一种。为了开发针对金黄色葡萄球菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法，本研究使用了1%柠檬酸三钠作为还原剂同氯金酸反应制备胶体金溶液，并调整用量优化粒径至10nm；选用优化的碳酸钾溶液调节pH,在该pH下金颗粒呈现电负性，而异硫氰酸荧光素则表现为正电性，进而在静电效应下发生了结合。优化之后的封闭液也具有极佳的保护性，可以保护金标垫上的金标抗体。在上述已优化条件下，我们制备了金标垫并加以烘干，将其置于玻璃纤维素膜上，之后试纸条的后半段喷涂了二抗和地高辛抗体，它们分别代表了质检线和检测线。以细菌的扩增产物在点样处进行加样检测，以条带的显色效果来对金黄色葡萄球菌做出判断。结果表明，PCR核酸免疫层析试纸条具备良好的特异性、灵敏性和可重复性。因此我们可以相信，核酸免疫试纸条可以在临床应用上发挥巨大作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法5
1.1材料5
1.1.1菌种5
1.1.2 设备与器材5
1.1.3 引物5
1.2 PCR扩增后DNA产物稀释倍数的优化5
1.3 不同纳米金粒径的优化5
1.4 胶体金pH的优化5
1.5 标记抗体标记量的优化5
1.6 封闭液的优化5
1.7 特异性实验比较6
1.8 敏感性实验比较6
1.9 重复性实验比较6
2 结果与分析6
2.1 PCR扩增后DNA产物稀释倍数的优化6
2.2 不同纳米金粒径的优化7
2.3 胶体金标记pH的优化8
2.4 FITC抗体加入量的优化9
2.5 封闭液的优化9
2.6 特异性实验比较9
2.7 灵敏性实验比较9
2.8 重复性和稳定性实验9
3 讨论9
致谢10
参考文献10
奶牛乳腺炎中金黄色葡萄球 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: &351916072& 
菌试纸条检测法的建立
引言
奶牛乳腺炎主要指发生在奶牛乳腺的各种炎症，其形成可能受到病原微生物、环境卫生、挤奶方式等多方面因素的共同影响，并且根据病程的不同，炎症的具体情况也会发生相应的改变，一般而言，我们将其分为亚临床型、临床型和慢型，但无论是哪一种类型，对于奶牛养殖业来说都是异常巨大的灾难[12]。针对这一情况，尽管科研人员在病原检测和症状治疗方面花费了巨大的心血和漫长的时间，情况有所好转，但其仍是奶牛饲养过程中花费成本最高的疾病之一,主要原因是引起该病的病原微生物在全国范围内广泛存在且发病率较高，其中主要的致病微生物为细菌[3]。根据病原学调查结果显示，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、停乳链球菌等细菌都可以引起该疾病，是主要的致病菌，并且没有明显的倾向性，致病几率相仿[46]。
在这些主要致病菌中，无乳链球菌在奶牛的皮肤表面、乳头附近以及乳头管当中都大量存在，在正常情况下奶牛的皮肤和关闭的乳头管都可以起到一定的屏蔽作用，但由于挤奶人员的操作可以导致乳头管暂时开放以及蚊虫可以协助破坏机体屏障等因素的存在，该致病菌都可以进一步扩散和传播，进入乳腺定殖以及在牛群内部分散，因此由链球菌引发的乳房炎往往具有高度的传染性，会引发奶牛场的大范围的流行性感染。停乳链球菌也是链球菌中的一种，革兰阳性菌，一般引起菌血症和脑膜炎，寄生于呼吸道、消化道和生殖道，传播速度快、范围广、传染能力强，有学者认为该链球菌甚至可以引发人畜之间的相互传播。金黄色葡萄球菌也是一种革兰阳性球菌，除了会导致奶牛乳腺的炎症以外，也会引致人类各个组织脏器的化脓性感染，比如肺炎、肠炎、以及心膜炎等多种疾病，广泛存在于自然界，是一种比较广泛且危害严重的致病菌。金黄色葡萄球菌可以通过粘附消化道粘膜和皮肤表面定殖机体而发生感染，之后再通过接触，进入乳腺并定居大量繁殖，进而引发奶牛的乳腺炎症。一般情况下，金黄色葡萄球菌的感染只会引发慢性的乳房炎，但是由于其传播能力强，常常引起奶牛场的大范围发病，并且因为其容易产生耐药性，难以治愈并且容易复发。大肠杆菌是革兰阴性杆菌，致病能力较强，可以通过产生相应毒素如不耐热性肠毒素等毒素引起机体患病，也可以进入血液大量繁殖，主要引发严重的腹泻和败血症，也是导致奶牛乳腺炎的重要致病菌之一。大肠杆菌广泛分布于自然界，可以通过粪便、土壤、水、饲料等进行传播，操作人员不正确的挤奶方式是使该菌传播的重要媒介，发病后容易发生恶化，在一些症状比较严重的案例中，大肠杆菌大量繁殖，细菌数量迅速上升，常常会达到一个极高的水平，并且往往会超过管控能力从而导致菌血症。此外，乳房炎症的发生不仅也会引起奶牛产奶量和牛奶的整体品质的下降，甚至能引发牛乳房内部组织的化脓性坏死使得泌乳能力大幅度下降，严重可以导致奶牛永远失去泌乳能力。大肠杆菌引发的乳房炎大多为急性，临床症状较为明显、治愈率低下且治疗成本较高，这对养殖业来说毫无疑问是一个巨大的灾难。
除了引发感染的致病菌种类不一以外，在奶牛乳腺炎的病例中隐性感染类型约占70%，即这类患病的奶牛在外观表现上基本没有任何异常，特别在患病的初期，我们几乎无法从外观表征获得任何有效信息，乳房表面没有明显肿块和红肿，乳汁中也不含有沉淀和异物，但若任其发展只会逐步恶化最终导致恶性乳房炎症引起牧场经济损失，这也为疾病的防控与治疗带来了一定的难度。基于这些因素的影响，开发出便捷有效、安全低廉的检测方法就显得尤为重要。
目前常用的奶牛乳腺炎诊断方法主要包括微生物学诊断技术、PCR检测技术、乳汁检测方法、热红外成像技术以及免疫学诊断技术。微生物学诊断技术主要是指细菌的分离鉴定，这是一种较为基础原始的检测方法，但其结果较为精确度和灵敏度都比较高，被称为诊断技术中的金标准。主要的流程为采集标本后（如奶牛的乳汁或者渗出物），先接种在增菌培养液中进行增菌，之后再平板划线分离出单个菌落进行纯培养并结合生化试验染色镜检等鉴别方式进行细菌鉴定，不过该方法也存在着操作复杂繁琐、整体耗时较长、培养成本较高等缺点，并不适合大规模的使用。在农场，加州乳腺炎实验应用较广，其工作流程比较方便简短，主要的工作原理是利用表面活性物质和碱性药物破坏牛乳中的体细胞，使之裂解并释放出DNA，释放出的DNA之后通过相关作用产生凝胶样的沉淀，体细胞数目越多则产生的凝胶样沉淀物便也越多，通过检测这个沉淀指标便可以从侧面诊断体细胞数目（SCC），进而诊断隐性乳腺炎，我国也开发了相关的诊断试剂盒用于检测，不过由于过于依赖操作人员的主观判断，误诊率是一个很大的问题[7]。在奶牛乳腺炎的诊断中，通过乳汁的各项数值进行检测也是重要诊断方法之一。目前关于乳汁的检测方法主要包括乳汁中体细胞计数、乳汁电导率测定、PH测定等方法。在欧洲，体细胞技术被广泛运用于奶牛乳腺炎的检测。每毫升牛奶中含有的体细胞的数目即为体细胞数（SCC），一般可以利用显微镜、电子记数仪等仪器进行记数。当奶牛发生乳腺炎症时，体细胞参与机体的防御，因此体细胞数目大大提升，由此可利用个体体细胞数来对牛是否患有乳腺炎症进行诊断，分别以20万/mL和50万/mL为隐性奶牛乳腺炎和临床乳房炎的界限，这种方法虽然具有很强的诊断能力但流程和检测时间过长，常常导致无法对疾病进行及时处理[8]，这也是该方法所存在的一个重大缺陷。此外Kirkeby C等学者[9]提出了差分体细胞技术（DSCC），因为SCC记数所得到的数值是整体的体细胞数，有时并不具备良好的代表性。他利用DSCC对三个主要目标细胞：中性粒细胞（PMN），淋巴细胞和巨噬细胞分别进行了统计，得到具体免疫细胞的百分比，可以为后期治疗防控提供方向。DSCC也被作为奶牛乳房健康新的检测工具并可以同时得到SCC数目，不过和普通的SCC计数一样，也存在检测流程和检测时间过长的缺点。乳汁电导率检测法也是常用技术之一，是依据机体血浆与乳汁的渗透压相等，健康奶牛的乳汁渗透压在很大程度上是由牛乳中的乳糖和氯化钠所决定的，当机体感染病菌并发生乳腺炎时，血乳屏障的屏蔽作用也会相应减弱，钠离子、氯离子顺势进入乳汁，从而影响乳汁的电导率，数值大幅度上升。根据这一原理可以通过对牛乳的导电率进行测定从而判断是否存在感染以及感染的程度。目前市面上已有较成熟的电导率测量产品，不过因为牧场的奶牛种类以及饲养管理的差异，不同牧场的正常电导率可能存在差异，没有一个既定的理论值，因此需要一个较长时间的观测来统计牧场相关数据并进行相关分析，才可以对这个值进行确认，比如冯军科等学者[10]通过对其进行牧场达六个月的测试，统计了相关数值，并计算了各月份电导率的平均值，之后再利用统计学的方法进行理论分析和数据处理，计算得到了各月份电导率阈值的变异相关系数，最终确定了其牧场的电导率阈值标准为9.3，依据电导率得出的结果在之后与使用隐性乳房炎测试液所得出的结果在比对中也表现出了良好的特异性与敏感性。这也说明在经过系统的统计后利用电导率也可简单便捷的诊断奶牛的患病情况，具有一定的可行性，但由于需要对大量数据进行比对，所以可能对牧场所使用的系统和观测时间有一定的要求。此外我们也可以通过奶牛乳汁的pH对疾病进行初步判断，其原理同电导率的测定有异曲同工之妙，患有乳房炎的病牛,常常在奶牛乳房炎症的作用下,导致乳房血管的扩张,渗透压也相应的随之增大,血液成分中一些相关物质例如白细胞、碳酸氢钠等都会随之而渗出并进入乳房腺泡,从而引起牛乳成分的改变。这些变化最终导致乳汁pH值升高,并且随着病程的前进，乳汁的PH也会持续升高并超过正常的阈值范围。一般来说正常乳汁的pH会保持在6.46.6之间；乳中体细胞数和pH也体现出一定相关性，一般当牛乳的体细胞数目维持在20万50万/ML时，乳汁的PH会在6.6～6.8之间波动；而当乳汁中的体细胞数维持在在50万500万／ML时， 乳汁PH则会在6.8～7.2之间波动；而乳汁体细胞数目超过500万／MＬ时，乳汁PＨ通常会上升至7.2以上。综上，我们可以通过检测奶牛乳汁的pＨ，观察记录变化情况，根据数据分析就可以对奶牛乳房炎的发病情况和发病程度做出估算,不过这些方法目前都存在着各自的局限性，比如检测时间较长，需要一个数据积累的过程。红外线检测技术的主要原理是物体表面的热量信号可以被红外线成像技术检测到并转化为电信号，这样我们就可以得到相关的红外线图像，目前应用中的红外线技术主要通过比对眼睛温度和乳房温度之间的差值变化来进行检测，如果超过一定阈值，我们便可以认为该牛患有该疾病，整体的准确率与这个阈值的划定有较大的相关性。张旭东等学者[11]在奶牛的挤奶通道上安装了射频识别器，并通过奶牛脚部的身份环做到信息的一一对应。通过摄像头对眼睛和乳房进行定位，利用热像仪分别读取眼睛与乳房的温度，并计算出差值。该学者通过数据统计，发现当乳房和眼睛的温差大于0.58摄氏度时，奶牛有很大几率患有该病，当然我们可以拉大这一差值以获得更的准确的结果，作者也因此划分了两个等级，等级一为0.58摄氏度差值，等级二为1.82摄氏度差值。经过比对。等级2的判定标准较为准确，可以达到87.5%，因为该方法的一体自动化程度较高，相信在之后也会有更好的发展前景。但热红外线检测技术虽有着不错的应用前景，不过目前仍处于实验阶段并且对于设备和员工的操作要求较高。免疫学检测主要是根据抗原抗体特异性结合的原理对病原菌进行检测，其方法便捷快速，但也易受操作人员的影响[12]。酶联吸附测定（ELISA）是一种较为常用的免疫学检测方式，主要原理是抗原抗体的特异性结合和酶的催化效应，我们可以将抗原或者抗体与固相载体结合并孵育一段时间后，加入待检液体，如果其中含有相关的抗原抗体物质就会同固相载体上的相关物质发生结合，之后再加入相关的酶标抗体或抗原，结合之后再加入显色底物，我们便可以通过肉眼或紫外分光光度计对这种底物的显色状况进行判断，这样便可以从侧面获得相关的数据。目前主要有直接法、间接法、竞争法等。直接法一般是已知抗体测抗原，间接法一般是已知抗原测抗体，竞争法可以检测一些小分子的抗原。Giulia Maria Grazia等学者[13]最近提出牛导管素酶联免疫吸附技术对牛乳腺炎进行评估，通过检测来自一群患有亚临床性乳腺炎病例的牛群中的618个牛乳样品，与细菌培养和体细胞记数的测定结果进行比对，通过将SCC> 200,000细胞/ mL（N = 242）的所有细菌培养阳性的四分之一视为真实阳性，以及将SCC <200,000细胞/ mL（N = 44）的所有无菌四分之一作为真实阴性评估：敏感性57.85％，特异性84.09％，阳性预测值95.24％，阴性预测值26.62％，准确度61.89％。因此，牛CATH ELISA在检测水牛乳腺炎中显示出相当的敏感性和良好的特异性。免疫学技术也可在奶牛乳腺炎的诊断过程作为有力的参考数据，但是ELISA 的流程并不简短，相关的单克隆抗体的制备也不是很方便，一般情况下只能用于实验室的检测，在现场的检测方面存在着局限性。

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