目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
文献综述2
1.材料与方法4
1.1靶序列选择 4
1.1.1目的基因下载5
1.1.2目的基因序列比对分析5
1.2.引物和探针的设计及检验5
1.2.1引物探针的设计5
1.2.2引物的特异性及质量检验6
1.3多重引物分析6
2.结果分析 6
2.1靶序列选择 7
2.1.1目的基因下载7
2.1.2目的基因序列比对分析7
2.2.引物和探针的设计及检验9
2.2.1引物探针的设计结果9
2.2.2引物的特异性及质量检验结果10
2.3多重PCR引物分析结果10
3.讨论 12
致谢12
参考文献13
PRV、PCV、PPV的多重TaqManqPCR检测方法的初步建立
摘 要
近年来，猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV）是猪场常见病毒性病原，也是造成母猪繁殖障碍的重要病原，给养猪业带来巨大经济损失。临床上PCR检测是主流的实验室检查之一。其中，TaqManqPCR检测方法和多重PCR检测方法分别因为其特异性强、灵敏度高和经济、快捷的优点，逐渐在临床得到广泛应用。无论是TaqManqPCR检测方法还是多重PCR检测方法，它们的特异性和灵敏性主要由引物和探针决定。本文拟初步建立PRV、PCV、PPV的多重TaqManqPCR检测方法，包括目的基因的挑选、基因序列的比对及分析、特异性引物和探针的设计、多重引物的分析等。最终确定，PRV、PCV、PPV三种病毒分别选择gE基因、ORF1基因以及NS1基因作为目的基因，毒株中各挑选出10株代表序列进行引物探针设计，所设计的引物探针序列位置均在目的基因保守区域；同时经过引物特异性、质量分析及多重引物分析，得出所得引物可用于多重TaqManqPCR检测方法的结论。
引言
引言
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养殖中母猪繁殖障碍会造成巨大的经济损失。母猪繁殖障碍主要指由感染性因素或非感染性因素导致母猪出现产死胎、木乃伊胎、胚胎死亡、不育（SMEDI）或弱仔、少仔的症状。而临床上最常见的病毒感染即猪伪狂犬病毒(Pseudoerabies,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的感染或混合感染。除此以外还有蓝耳病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒等病毒性感染和大肠杆菌等细菌感染均可引起母猪繁殖障碍。因此建立出高效、特异性好、快速的诊断方法十分重要。临床常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和（VN）实验、乳胶凝集试验（LAT）、免疫组化、聚合酶链式反应（PCR）等，其中以PCR检测方法应用最广。本课题分别选择PRV、PCV和PPV的gE、ORF1和NS1基因作为引物和探针设计的目的基因以用于TaqManqPCR检测方法和多重PCR检测方法，主要就如何设计引物和探针以及如何分析引物特异性展开论述。TaqManqPCR检测方法具有重复性好、特异性强、灵敏性高、可实时定量分析、线性范围宽等特点；而多重PCR具有灵敏快捷、低成本、适合大规模检测等优点，在临床上用于多种病原混合感染的检测，尤其是能引起相同或类似临床症状的病原。在PRV、PPV和PCV混合感染方面，也有建立相关的多重PCR检测方法的报导。无论是哪一种PCR方法，其特异性和灵敏性主要由引物和探针的特异性决定。故设计出特异性好质量高的引物和探针是PCR检测方法中的关键一步。引物和探针的设计多依赖于国内外生物科技公司提供的设计服务，或者国内外的一些引物设计软件，故本课题在技术支持方面可以得到保障；而关键在于如何分析引物质量，判读引物分析结果。
文献综述
PRV属于水痘病毒属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，目前仅知一种血清型。PRV的基因组大小约为140~143Kbp，并包括至少72个可读框以编码70种不同的蛋白质。除了挪威、澳大利亚、以及大部分东南亚海岛，伪狂犬病（AD）几乎在全世界均有分布。利用Bam HⅠ限制性片段长度的多态性，对大量PRV分离株进行分子特征描述，发现了四种主要基因组类型。Ⅰ型主要在美国和欧洲中部被发现，而Ⅱ型和Ⅲ型分别在中欧和北欧传播，Ⅳ型仅限亚洲流行[14]。该病在临床上引起小于7日龄的新生仔猪的突然死亡；引起2至3周龄的仔猪严重的中枢神经损伤症状，如颤抖、失衡、抽搐、震颤、共济失调及麻痹，并伴有高达100%的死亡率；随着感染猪只的年龄的增长，死亡率逐渐降低。母猪的感染症状除了母猪繁殖障碍综合症状，可能还会有呼吸道症状。
猪细小病毒属于细小病毒科细小病毒亚科，有7种血清型（PPVs17），其基因组是一个约有5000碱基的单链DNA分子。该基因组编码四个从两个启动子转录的蛋白质：两种非结构蛋白NS1和NS2，以及两种结构蛋白VP1和VP2。其中NS1和NS2在病毒复制过程中发挥作用，尤其是在DNA的复制中[5]。在国内的PPV流行调查中发现，PPV1分布范围最小，PPV2流行范围最广，其他各型在国内各省市均有分布，而近两年发现的PPV7成为最近的主要研究对象[6]。PPV导致的具体临床症状主要因母猪发生感染的妊娠阶段不同而同。在妊娠初期，胚胎受到透明带的保护，不易受到感染；此后，直到妊娠第35天左右，PPV1感染会导致胎儿死亡以及母体对胎儿组织的吸收；在妊娠35天以后的PPV1感染通常会导致胎儿死亡，随后发生木乃伊化（干尸化）；在妊娠70天左右，胎儿感染呈现出亚临床症状，且仔猪出生时就带有抗PPV1抗体[7][8]。

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