目录
摘 要 II
ABSTRACT III
第一章 引言 1
1.1 溶酶体贮积病 1
1.2 α半乳糖苷酶缺失型溶酶体贮积病 2
1.3 细胞治疗研究进展 2
1.4 研究目的、内容及意义 4
第二章 干细胞来源的工程化红细胞治疗α半乳糖苷酶缺陷型溶酶体贮积病 5
2.1 材料与方法 5
2.1.1 菌种、细胞、质粒 5
2.1.2 主要试剂 5
2.1.3 αGAL的克隆 5
2.1.4 重组载体的构建 5
2.1.5 细胞培养、传代 6
2.1.6 MSCVαGALGFP载体转染HEK293T细胞 6
2.1.7 慢病毒感染K562细胞 7
2.1.8 Westernblot检测αGAL表达情况 7
2.1.9 αGAL酶活检测 7
2.1.10 工程化胚胎干细胞来源的红细胞 7
2.1.11 工程化红细胞的αGAL表达及酶活检测 7
2.1.12 小鼠基因型鉴定 8
2.1.13 细胞治疗 8
2.1.14 冰冻切片 8
2.2 结果与分析 9
2.2.1 慢病毒构建 9
2.2.2 慢病毒包装 9
2.2.3 αGAL的表达验证 10
2.2.4 重组表达产物的功能验证 11
2.2.5 胚胎干细胞的分离培养 12
2.2.6 胚胎干细胞的工程化 12
2.2.7 工程化干细胞对αGAL基因型缺失小鼠治疗观察 14
2.2.7.1 小鼠基因型鉴定 14
2.2.7.2 αGAL基因缺陷型小鼠细胞治疗 14
第三章 总结与讨论 16
3.1 溶酶体贮积病的治疗 16
3.2 细胞治疗 17
3.3 干细胞来源的工程化红细胞药物载体平台 17
参考文献： 20
附录一：α半乳糖苷酶基因缺陷类型 22< *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: *351916072* 
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缺陷型溶酶体贮积病
摘 要
α半乳糖苷酶（αGAL）缺陷型溶酶体贮积病又被称为Fabry病，主要由于X染色体上αGAL基因突变致溶酶体中缺少水解酶，导致化合物三聚己糖神经酰胺在体内贮积。目前溶酶体贮积病的治疗方法有骨髓移植、底物抑制、酶替代等，但是存在配型困难、免疫抑制、药效维持时间短、治疗成本高等问题。本试验将αGAL基因克隆至慢病毒载体MSCVGFP中，与包装载体共转染HEK293T细胞包装为慢病毒，然后感染K562细胞和胚胎干细胞，检测αGAL的表达情况和酶活性。将感染后的干细胞通过眼眦注射基因缺陷型小鼠，检测小鼠肝脏酶活和肾脏底物堆积情况，观察干细胞来源的工程化红细胞对αGAL缺陷型溶酶体贮积病的治疗作用。结果显示成功构建了慢病毒载体并在HEK293T细胞中包装慢病毒，病毒感染K562细胞效率高于50%。Western blot结果显示成功在细胞中表达了αGAL，且活性提高到原来的5倍左右。通过分离小鼠的胚胎干细胞，在体外工程化并诱导向红细胞分化作为细胞治疗药物，成功检测到了αGAL及活性。在αGAL基因缺失小鼠上进行体内实验，小鼠体内酶活明显升高，组织切片检查肾脏的三聚己糖神经酰胺堆积明显减少。在体内体外证明了此系统能够有效提高酶活、减少底物的堆积，为治疗溶酶体贮积病提供了新的方法和参考。
引言
1.1 溶酶体贮积病
溶酶体是真核细胞的一种细胞器，含有蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等六十余种水解酶，不仅能够分解消化掉外源的病菌和异物，而且能够清除掉自身衰老的细胞和生物大分子，在机体防御外来物质和自我更新中具有重要的作用[1]。溶酶体中的某些酶发生缺陷时，会导致相应的底物无法被分解堆积在体内，严重影响机体的正常生理功能，此类疾病被称为溶酶体贮积病（lysosomal storage disease，LSD）。十九世纪八十年代，医生在临床中发现了此类疾病，但当时由于人们还没有溶酶体的概念，对发生的原因和机制都不清楚。Pompe病是第一个发病机制被明确阐述的溶酶体贮积病，随后超过四十种的溶酶体贮积病被发现，包括Gaucher病、Sanhoff病、Wolman病等，其中大部分为常染色体隐性遗传（Fabry为伴X染色体遗传）[2]。溶酶体贮积病的发生机制通常是由于染色体上的基因突变,导致相应的酶出现缺陷，底物代谢出现异常导致疾病发生。如糖原贮积病Ⅱ型（Pompe病）常见的基因突变有Asp645Glu、缺失525T、缺失外显子18等。根据溶酶体内堆积的物质类型，溶酶体贮积病的分为不同的类型（表Ⅰ1）[3]。研究发现不同地区不同人种的发病率及突变类型存在较大差异，新生婴儿的发病率在1/15001/7000[4]。由于个体差异和缺失基因的不同，此病的临床特征具有多样性，有些患者在出生时无明显症状，成年后出现与堆积底物相关的临床症状，多数患者在出生时就有明显的表现，典型的症状为神经和多织器官受累，由于神经细胞不能自我更新和分化，随着底物的不断积累，表现为轴突和细胞形态的变化，进而影响功能[5]。

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