猪卵巢卵泡颗粒细胞（granulosa cells, GC）是卵泡中除卵母细胞外卵泡的主要组成成分，在卵泡发育过程中发挥着至关重要的作用。大多数卵泡在发育过程中都会走向闭锁死亡，目前认为闭锁主要是颗粒细胞凋亡的过程。褪黑素（melatonin, MT）具有调节生物节律，调控生殖活动，抗氧化等多种生物学功能。有研究报道，褪黑素可参与颗粒细胞凋亡信号通路的调节，影响颗粒细胞的生长发育，但其具体影响尚需补充和验证。本课题以体外培养猪卵泡颗粒细胞为研究对象，利用外源添加不同浓度的褪黑素（0, 10-9, 10-7, 10-5, 10-3 M）处理，通过qRT-PCR、Western Blot和流式细胞仪分析检测凋亡相关基因Caspase-3，P53，BCL-2，BAX的表达与颗粒细胞凋亡状况，探究褪黑素对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响。结果发现，褪黑素对体外培养的猪卵泡颗粒细胞凋亡影响较小。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1试验材料 3
1.2试验方法 4
1.2.1颗粒细胞的分离和处理培养4
1.2.2 qRTPCR检测凋亡相关基因mRNA表达4
1.2.3 Western blot检测凋亡相关基因蛋白表达6
1.2.4 Annexin V/PI凋亡检测8
2结果与分析8
2.1不同浓度褪黑素对颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响8
2.1.1不同浓度褪黑素对Caspase3蛋白表达的影响8
2.1.2 不同浓度褪黑素对颗粒细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响9
2.2不同浓度褪黑素对颗粒细胞凋亡的影响10
3讨论 10
致谢11
参考文献12
褪黑素对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响
引言
引言 雌性动物卵巢上的卵泡一直处于动态变化过程，原始卵泡经过初级卵泡、次级卵泡与三级卵泡几个阶段逐渐发育为成熟卵泡，成熟卵泡破裂后释放出内容物形成黄体。原始卵泡、初级卵泡到次级卵泡阶段尚未出现卵泡腔被称为腔前卵泡， *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072# 
三级卵泡与成熟卵泡则为有腔卵泡。整个过程中，大量颗粒细胞伴随着卵泡发育在卵泡中增殖、分化、凋亡。颗粒细胞分为壁层颗粒细胞与卵丘细胞，前者分布于卵泡壁内侧，后者包裹着卵母细胞，通过间隙连接对卵母细胞提供营养支持并调控卵母细胞发育[1]。大多数卵泡在发育过程中退化而不能发育成熟，即卵泡闭锁。卵泡闭锁对优势卵泡的发育有重要意义，但若出现异常的卵泡闭锁则会影响雌性动物的繁殖性能甚至造成不孕不育。颗粒细胞的凋亡是成熟卵巢中卵泡闭锁的实质[2]，也是卵巢早衰的直接因素[3]。因而，研究颗粒细胞的凋亡对卵泡发育的调控具有很大意义。
凋亡（apoptosis）是细胞在生理或者病理条件下由基因和一系列酶参与控制的自主死亡过程[4]，被称为I型程序性死亡。目前已确定有三条细胞凋亡途径：死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。总体来说凋亡主要由Caspase家族、Bcl2家族、衔接蛋白、凋亡抑制因子参与调控[5]。调控颗粒细胞凋亡的相关基因可以分为促凋亡基因和抗凋亡基因。促凋亡基因主要包括Caspase3、P53、BAX、原癌基因cmyc等，抗凋亡基因主要有BCL2、原癌基因ras等。Caspase家族可通过线粒体途径与死亡受体途径调节细胞凋亡。其中Caspase3为该家族核心成员，是细胞凋亡活化的关键蛋白酶，是目前已知的凋亡最后执行因子，被作为凋亡进入不可逆阶段的标志[6]。Bcl2家族主要作用于线粒体膜，其中BCL2基因与BAX基因都是Bcl2基因家族成员，两种基因具有拮抗作用。除基因层面外，一些细胞因子和激素也可介入细胞的凋亡。如抑制细胞凋亡的生长分化因子，促进细胞凋亡的肿瘤坏死因子等[7]。近年来，有研究显示褪黑素也可影响细胞的凋亡。
褪黑素（melatonin, MT）是一种重要的吲哚类激素，也被称为松果腺素，属于非极性的脂溶性分子，很容易穿透细胞膜作用于受体。褪黑素广泛可见于各种生物，生物体内各个部位。脊椎动物的垂体、胃肠道、卵巢、睾丸、周围神经及交感神经等均可产生褪黑素[8]，其中松果腺是最主要的褪黑素分泌部位[9]。目前褪黑素调节生物节律，清除氧自由基，控制生殖器官发育，抑制胃肠运动，参与免疫兴奋等作用已被广泛认可[10]。关于褪黑素的抗肿瘤效果的研究也有不少，发现其主要通过抑制细胞的增殖、侵袭、代谢，促进细胞凋亡来实现[11]。
有很多研究显示褪黑素可影响细胞的凋亡。研究发现，卵泡中褪黑素水平与代表卵泡凋亡程度的标记物8OHdG水平呈负相关[12][13]；给小鼠注射10 mg/kg的褪黑素可抑制BAX基因的表达从而减少小鼠肝细胞的凋亡[14]；向老龄大鼠的饮水中添加褪黑素，可抑制线粒体细胞色素和BCL2水平上升[15]；用褪黑素处理的颗粒细胞其细胞周期基因CCNA2、CCNB1表达显著上调，促凋亡基因Caspase3表达下降[16]；在热应激条件下，褪黑素下调颗粒细胞P53，上调BCL2和LH受体基因表达[17]。也有研究表明，用0.01 ng/mL褪黑素处理颗粒细胞可促进其增殖活力及集落形成，抑制其凋亡[18]。这些研究均证明了褪黑素对包括颗粒细胞在内的细胞凋亡的抑制作用。但褪黑素对卵泡颗粒细胞凋亡的影响仍需进一步验证。并且在相关体外培养的研究中，选择合适剂量的褪黑素进行试验对研究的准确性有着重要意义。于是在本课题中，我们以体外培养的猪卵泡颗粒细胞为模型，选取了0, 109, 107, 105, 103 M 五组梯度浓度的褪黑素进行处理，通过qRTPCR和Western blot技术检测细胞中Caspase3，P53，BCL2，BAX四个凋亡相关基因的表达情况，并使用流式细胞术进行凋亡检测，来探索褪黑素对猪卵泡颗粒凋亡的影响，为今后的相关研究提供参考。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 样品 本试验所用卵巢来自于南京周边屠宰场。所有动物实验均符合大学动物福利研究委员会的管理规定。
1．1．2 试剂 褪黑素；DMEM/F12培养液；RIPA组织/细胞裂解液；PMSF；BCA法蛋白浓度测定试剂盒；Trizol RNA提取试剂；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser；SYBR® Premix Ex TaqTM II；琼脂糖；RNasefree ddH2O；DEPC；Caspase3一抗及HRP标记的lgG二抗；βTubulin抗体；ECL化学发光液；牛血清蛋白（BSA）；TEMED；硝酸纤维素膜（NC膜）；滤纸；考马斯亮蓝；丽春红S；台盼蓝；氯仿；异丙醇；无水乙醇；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒

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