目的本文主要是为了研究萝卜硫素对卵泡颗粒细胞肌肉生长抑制素（MSTN）表达的调控。方法将新鲜获取的猪卵巢颗粒细胞随机分为5组，每组5个重复，分别设为对照组和SFN组（按浓度梯度分为四组），检测对照组与SFN处理组细胞增殖活性与MSTN表达水平。选取4周龄的ICR小鼠为研究对象，分为对照组、单剂量灌胃和多剂量灌胃三组，每组3个重复，饲喂结束后，称量小鼠体重及卵巢重量，与此同时收集有腔卵泡颗粒细胞，提取细胞mRNA与蛋白后，检测MSTN、FSHR和LHR的表达水平。结果低浓度SFN显著提高体外培养猪卵泡颗粒细胞的增值活力（P<0.05），并且显著促进了myostatin基因的转录与蛋白合成。小鼠灌胃SFN对体重和卵巢重无显著影响，卵泡颗粒细胞FSHR与LHR的表达没有受到SFN的影响，然而MSTN的表达在SFN灌胃后显著升高。结论体内、体外萝卜硫素显著促进了卵泡颗粒细胞MSTN的表达。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1实验动物 3
1.1.2实验仪器 3
1.1.3实验试剂 4
1.2实验方法 4
1.2.1体外实验6
1.2.2 体内实验6
1.2.3 统计学处理6
2结果分析6
2.1 SFN对猪卵泡颗粒细胞增殖活力的影响6
2.2 SFN对猪卵泡颗粒细胞MSTN表达的调控7
2.3单次灌胃SFN对小鼠卵泡颗粒细胞MSTN表达的影响7
2.4多次灌胃SFN对小鼠卵泡颗粒细胞MSTN表达的影响7
3讨论 8
3.1影响试验成功的因素 8
3.1.1卵泡颗粒细胞的获取 8
3.1.2蛋白印迹法的注意事项 8
3.1.2实时荧光定量PCR的注意事项 8
3.2 SFN具有明显的剂量效应 8
3.3 SFN是卵泡颗粒细胞MSTN表达的有效促进剂 8
致谢9
参考文献9
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萝卜硫素对卵泡颗粒细胞肌肉生长抑素表达的调控
引言
肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）又被称为生长分化因子8（GDF8），作为转化生长因子β超家族的一员，它可以抑制骨骼肌的生长发育，因此得名。MSTN是一种分泌蛋白，主要在肌肉组织中表达，有研究报道：肌肉外组织，例如脂肪组织、心脏和脑组织也有检测到MSTN基因的表达，更进一步，在哺乳动物的淋巴组织、胎盘组织、内膜细胞均有表达。MSTN是肌肉生长负调控因子，MSTN基因的过表达会阻碍动物机体肌肉的生长，抑制MSTN表达或功能可以显著促进肌肉生长。在MSTN基因自然突变纯合子动物（如牛、猫等）和人为敲除纯合子动物（如小鼠、猪等）都能观察到肌肉的过度生长，出现所谓“双肌”表型。有研究发现，卵泡抑素（FST）可以通过阻断MSTN/Smad信号通路来减少MSTN对MyoD的抑制作用，从而促进肌肉的生长发育。FST在动物肌肉增殖、分化、生长以及发育过程中的生物学作用与MSTN存在明显的拮抗作用，过表达FST的小鼠肌肉生长发育较快且肌肉质量明显增加，研究发现FST可以与MSTN直接结合，从而阻止MSTN与其受体结合，解除其肌抑制作用。
MSTN作为TGFβ超家族成员还能通过Smad信号对细胞的增殖分化与凋亡产生调控作用。MSTN的受体是跨膜蛋白，其中分为激活素受体Ⅰ型和激活受体Ⅱ型。MSTN同源二聚体C端首先结合细胞膜表面受体ActRIIB，然后招募ActRI型受体形成受体复合物，进而使细胞质中的Smad2和Smad3磷酸化。随后Smad4结合Smad2/Smad3形成Smad蛋白复合物，进入细胞核后与转录因子结合，识别基因特异序列，抑制或促进靶基因的表达。不同的转录因子与Smad2/3/4结合，导致Smad信号通路发挥功能也各不相同。其中，胞浆蛋白SnoN和Ski与Smad2/3/4结合，阻止Smad复合物活性，然后招募共阻遏物和组蛋白乙酰酶复合物抑制靶基因的表达。此外，Smad7能阻止ActRI磷酸化RSmad蛋白，也可能使TGFβ受体降解，从而阻断Smad蛋白介导的MSTN信号通路。因此，抑制MSTN信号通路中的任何 一部分，都可以影响MSTN生物学功能。
MSTN对肌肉生长发育强大的调控作用在畜牧学以及医学方面都有良好的应用前景。在畜牧生产中可以通过抑制MSTN的表达与功能促进动物肌肉生长，从而提高生产效率；在医学方面，肌肉生长抑制素已成为治疗骨骼肌萎缩相关疾病的新靶标。
以MSTN为靶标，寻找调控MSTN表达与功能的天然小分子化合物有助于建立调控肌肉生长发育的新技术。有研究发现，十字花科植物富含的小分子化合物萝卜硫素（SFN）能够抑制体外培养肌肉卫星细胞MSTN的表达。课题组最近研究发现，在猪卵泡颗粒细胞中也存在MSTN基因表达，SFN对卵泡颗粒细胞MSTN的表达是否具有调控作用尚无相关研究报道。为此，本文研究了SFN对体内、外卵泡颗粒细胞MSTN表达的影响，为研究MSTN在卵泡中功能以及利用SFN调控卵泡发育奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物
本实验选取4周龄的ICR小鼠为研究对象，以每笼5只的密度恒温饲养，自由采食饮水。将小鼠随机分成对照组与试验组，试验组又分成单剂量灌胃组和多剂量灌胃组，每组5只小鼠。所有动物实验都遵循大学实验动物福利伦理审查委员会的要求进行。
猪卵巢取自南京市天环屠宰场商品猪，在屠宰后几分钟之内取双侧卵巢，放置于37℃含有抗生素的生理盐水之中，1h内送到实验室，进行后续的实验。
1．1．2 实验仪器
超净工作台：上海博讯实业有限公司
高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂
千分之一电子天平：Yamatoz公司
超低温冰箱：Thereto公司
高速冷冻离心机：Eppendorf公司
实时荧光定量PCR仪：AB17300，美国ABI公司
DYYIII2电泳仪：北京六一仪器厂
电泳凝胶成像仪：BioRad公司
1．1．3 实验试剂
RIPA强裂解液：碧云天生物技术研究所
DNA Lader Marker：北京天根公司
扩增引物与QPCR引物：上海英骏生物技术公司
凝胶回收试剂盒：AXYGEN
血清，青霉素，链霉素：Gibco 公司

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