目录
引言
1 引 言 1
1.1 课题背景 1
1.2 国内外研究现状 1
1.3 拟解决的关键问题 2
1.4 目的与意义 2
1.5 项目前景 3
2 文献综述 4
2.1 昼夜节律概述 4
2.2 肠道微生物数量及功能 4
2.3 肠道微生物与昼夜节律 4
3 方案论证 7
3.1 试验方案 7
3.2 方案可行性 7
4 自由采食模式下育肥猪结肠菌群节律 8
4.1 材料与方法 8
4.2 结果与分析 9
4.3 讨 论 13
4.4 结 论 15
参考文献 16
致 谢 19
引言
课题背景
漫长的演化历程中产生了许多与人共生的微生物，近年来人体微生物组计划掀起了研究微生物的热潮[1]。其中肠道微生物的种类以及所编码的基因数量均远大于人类本身，由于总质量接近肝脏被称为一大特殊器官[2]，参与生理代谢、神经调控、免疫调节等过程[35]。
来源于母体、日粮、环境的微生物在宿主内定植，并构成肠道内特殊的群落结构[6]。随着动物日龄增长和外界环境的不断改变，肠道菌群的数量结构也处于动态变化之中[7]。肠道菌与宿主共同构成维系机体健康的微生态系统[8]。该系统能够分解消化道内的营养物质驱动微生物能量代谢，通过改变肠道黏膜屏障通透性、释放代谢产物、调节宿主活动。然而，当受到环境、饮食、作息改变的影响，肠道微生态将失去原有的稳衡状态，患肥胖、炎症性肠病的几率上升[8, 9]。
自然界存在四季变换、昼夜更替等周期性现象，生物在与自然相适应的过程中也衍化出自身的节律性，以地球自转产生的光暗循环是构成昼夜节律的主要因素，研究发现哺乳动物的新陈代谢具有明显的24h周期变化[10]。该规律与内源时钟基因的转录表达有关，参与宿主多种代谢调控。值得注意的是，有学者发现肠道菌群的结构数量存在以一定时间为单位的周期性振荡，并且伴随着肠道上栖息位置的改变。
目前，仍不清楚这种节律现象是否为肠道微生 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
态维持稳定的因素，肠道微生物能否通过该途径影响宿主内源节律，或通过与肠道不同区段相互交流实现参与调控宿主生理活动。当前国内外相关研究多基于模式小鼠展开，发现了肠道菌群节律的大致规律，然而鼠类作为典型的夜行性动物与人类存在较大差异，而与人作息相近的猪尚无系统性研究。因此，本课题以育肥猪作为试验对象，分析比较结肠菌群在昼夜不同时间点数量组成上变化，以期较为全面地阐明肠道微生物的节律性变化，为丰富肠道微生态理论提供实际依据。
国内外研究现状
昼夜节律是生物体适应环境中光照、温度等因素的自主时间机制[11]，被认为几乎是所有活细胞的特征之一，在行为、生理、代谢等方面都显现出以24h自我维持的周期循环[12]。在分子水平上，昼夜节律机制通过负反馈循环得以实现，然而该体系在不同生物之间并不共享，在原核生物中以翻译后水平的磷酸化修饰介导，而在真核生物中以基因表达的转录—翻译负反馈回路为主，这意味着时钟蛋白表达在两类生物中不体现保守性，例如果蝇和人虽然具有同源的period基因,但各自发挥的功能有所不同[1315]。因此对于各种生命形态的节律机制的研究一直存在着难以逾越的障碍。Eager等受到光合细菌起源导致的大氧化事件启发，意识到好氧生物必须具备活性氧清除系统，发现了过氧化物酶蛋白家族在不同生物之间存在较高的保守性，提出利用氧化还原循环作为各种模型生物周期振荡的通用标记，一定程度上推动了生物节律研究[15]。
有关微生物节律研究可以追溯到对于光照敏感的单细胞原核生物蓝细菌，Johnson等[16]发现了其在24小时内蛋白质磷酸化的振荡现象。然而该研究仅证实了离体培养的单一品种细菌所表现出的节律性，尚不清楚多种微生物构成的复杂群落系统是否也存在周期变化，尤其是那些未直接暴露在光暗环境中的菌群。为此，Thaiss等[17, 18]以小鼠肠道微生物群为研究对象进行了较为系统性的试验，发现了大部分微生物呈现出规律性的数量差异变化、地理位置移动、基因表达波动、代谢产物振荡等现象。同时，他们发现核心钟基因敲除小鼠菌群节律受到宿主节律的调控，且宿主昼夜节律与进食时间密切相关，可以通过进食节律干预肠道内菌群的节律性，从而在核心钟基因受损的小鼠肠道内重构模拟的人工昼夜节律。此外，他们还在小鼠模型上模拟倒时差现象，将光暗周期滞后一段时间并恢复正常，发现了菌群节律也存在先滞后再恢复的现象，同时存在明显的脂肪增加，说明跨时区产生的时差效应在一定程度上改变了人类肠道菌群昼夜节律进而引起一系列代谢失调，进一步研究表明这种失调不同于肠道菌群物种构成缺失导致的紊乱，昼夜节律的消失可能独立发生[17]。
以上研究较为系统地阐释了不直接暴露于光暗环境的复杂微生物群落也能表现出昼夜规律性变化，这种变化受宿主昼夜节律的调控特别是进食节律的影响。此外，该周期性振荡不同于微生物群落多样性缺失而导致的菌群紊乱，可能通过与肠道细胞接触、代谢产物波动等方式参与宿主生理代谢活动进而与代谢疾病密切相关。不过，啮齿类动物多为夜行性，进食等行为引起的代谢高峰也多集中在夜间，昼行性哺乳动物肠道菌群是否也具有节律尚不明确。猪与人在昼夜活动方面有一定的相似度，因此本试验以猪为模型，尝试阐明猪肠道微生物的节律现象，以期丰富昼夜节律理论。

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