精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性动物睾丸曲细精管基膜上的生殖系干细胞，其不仅能始终保持自我更新能力，也可在多种生长因子、微环境和自身信号调控下最终定向分化为精子。精原干细胞自我更新的稳定性是一个细胞维持自身生存，进行稳定增值且保持未分化状态的程序复杂而又高度协调的过程。精原干细胞的自我更新是一个复杂的调控过程，研究表明该过程受到许多与细胞更新相关的基因和生长因子的调控。有证据表明细胞自噬是细胞命运调控的重要途径。自噬是细胞内源性的一种保护性的物质周转途径,通常自噬过程有利于维持细胞的物质代谢平衡和受损细胞器的更新,而自噬水平异常可能导致细胞清除有害物质的能力下降,诱发应激、炎症甚至细胞死亡等不良后果。为了研究精原干细胞的自噬水平与自我更新能力的关联性，本实验以小鼠的原代精原干细胞作为实验模型，对精原干细胞进行分离与建系和特性鉴定，确定分离的细胞即是精原干细胞，通过体外对精原干细胞添加白消安，自噬激活剂雷帕霉素或自噬抑制剂氯喹，探究自噬在白消安诱导的精原干细胞损伤中的作用，结果显示白消安对精原干细胞具有损伤作用，且能使自噬小体发生聚集，启动精原干细胞的自噬过程，但是否能成功诱导自噬，以及自噬活性与精原干细胞自我更新能力之间的关联性仍不明确。本研究初步探究了白消安对精原干细胞中自噬的影响，为揭示自噬对白消安诱导的精原干细胞损伤的作用关系以及自噬对精原干细胞自我更新能力的影响提供新思路，具有一定的参考价值。
目录
摘要3
关键词3
Abstract4
Key words4
第一章 文献综述5
1.精原干细胞5
2.自噬5
3.自噬对干细胞的影响6
4.本试验研究的目的和意义6
第二章 试验研究7
1.引言7
2.材料与方法7
2.1实验材料7
2.1.1实验动物7
2.1.2主要试剂 7
2.1.3主要仪器设备8
2.2实验方法8
2.2.1小鼠精原干细胞分离纯化及培养8
2.2.2小鼠精原干细胞免疫荧光实验8
2.2.3白消安和自噬激活剂 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
、抑制剂的添加8
2.2.4Western Blot分析9
2.3实验结果9
2.3.1小鼠精原干细胞纯化及培养9
2.3.2小鼠精原干细胞的特性鉴定10
2.3.3白消安处理小鼠精原干细胞后细胞中的自噬的情况10
2.4讨论11
参考文献12
致谢13
自噬水平与精原干细胞自我更新能力关联性的初步研究
引言
文献综述
随着科学技术的不断发展，人们对生殖繁育的认识逐渐加深，其中对于解决男性不育问题的研究也更加深入。以遗传学角度作为出发点，精原干细胞具有将自身遗传信息传递给下一代的作用，并通过这个过程保证了该物种个体之间的联系性，所以精原干细胞保证自身遗传信息的稳定性，特别是在保证精子正常发生和精子质量方面具有极其重要的意义。因此，通过研究体内微环境、生长因子和调控信号对精原干细胞生长发育的调控机制，对于解决男性精子发生障碍等问题具有重要意义。
精原干细胞
精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是雄性动物睾丸的曲细精管基膜处的一类未分化的精原细胞，其既能自我更新、维持自身群体恒定；又能定向分化产生精母细胞、精细胞等多种亚型[1]。精原干细胞通过增殖和分化最终会发育成为成熟的精子，此过程复杂有序，要求有一个数量恒定且可以连续分化的细胞群，所以精原干细胞必须具备不断自我更新和复制的能力[2]。精子发生可以分为精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子的发育形成三个阶段。精原干细胞是精原细胞的一个亚群,其具有的自我更新能力维持了干细胞系的稳定，也会分化产生大量的生殖细胞。因此，保证精原干细胞自我更新与分化发育之间的相对平衡对保证精子正常发生起到了至关重要的作用。精原细胞通常被分为A型、中间型和B型精原细胞。A型精原细胞可以根据细胞分化等级进一步分为未分化状态的和分化的精原细胞。未分化的精原细胞包括Asingle型（As）、Apaired型（Apr）和Aaligned型（Aal）精原细胞三种类型，而分化的精原干细胞有A1～A4型四种[3]，As精原细胞是精原干细胞富集的细胞群，一个As细胞通过有丝分裂产生2个胞质桥相连的2个Apr细胞，Apr细胞可能会形成两个As精原细胞，或继续分化成Aal精原细胞，并进一步分化最终形成精子。
精原干细胞自我更新受到复杂的调控，细胞微环境、许多基因及生长因子参与了该过程。精原干细胞周围的各种细胞分泌的激素和生长调节因子为其创造了更新和增殖的微环境，微环境中的调控因子主要包含转化生长因子、Ets转录因子家族以及锌指蛋白等，但精原干细胞的更新和分化也受到了细胞源性神经生长因子(GDNF)、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)等相关因子的精确调控。
自噬
自噬是细胞的一个自我保护机制，通过将自身的异常蛋白和受损的细胞器吞噬入囊泡，随后与溶酶体融合并由溶酶体充分降解，从而达到清除细胞内部有害组分，实现其自身的环境稳态和物质代谢平衡。根据将需降解物质运输到溶酶体内的途径不同，自噬被分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导自噬三种不同类型。大自噬是指自噬体是由内质网来源的膜包裹降解物质而形成的，然后包裹着降解物的自噬体与溶酶体发生相互融合，最后被溶酶体内的酶类物质所降解。小自噬是指溶酶体的膜直接包裹蛋白并进行降解。分子伴侣介导的自噬需要通过分子伴侣将需要降解的蛋白质结合到自身后，再转运到溶酶体中最后被消化。再者三种不同类型的自噬中，分子蛋白所介导的自噬其底物是可溶性的蛋白质分子，这是一个对蛋白进行选择的过程，而大自噬和小自噬对于底物则无明显的选择性。虽然三种自噬的发生途径和所降解的底物有所不同，但是对与细胞自身抵抗外界刺激，维持内部稳定都起着极其重要重要的作用。通常来说，自噬的发生过程主要包括自噬的启动以及自噬体的延伸、成熟和降解四个阶段。首先，细胞受到外界刺激而引起内部自噬信号启动，接着细胞质中形成双层膜的杯状自噬前体[4]。然后，自噬前体在某些蛋白的作用下发生延伸。已经得到延长的自噬前体将包裹需要降解的底物，最终实现自噬泡的完全闭合[5]，即达到成熟阶段。最后，自噬泡与溶酶体相遇，并与其外膜相互融合，自噬泡内包裹物在溶酶体内的水解酶作用下发生降解。此外，在自噬泡内包裹物完全降解后，会从自噬溶酶体上生成一个管状结构，该结构可以从顶端断裂从而形成新原溶酶体，通过溶酶体的水解酶的作用形成成熟的溶酶体[6]。
细胞自噬涉及多种细胞的生理活动，目前认为其功能主要包括：（1）为细胞提供能量支持，可以通过降解底物提供一些新陈代谢和生物合成的原料。（2）自噬可以认为是一种细胞维持自身内环境稳定的途径。通过自噬清除细胞内异常蛋白和降解受损细胞器，实现细胞内物资维持的稳态。（3）细胞自噬通过引发Ⅱ型程序性细胞死亡，清除机体内异常或无用的细胞。此外，自噬在特定的组织中还有特殊的功能: 如参与肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质在细胞内合成; 在红细胞成熟过程中负责清除线粒体、核糖体等,在红细胞成为双凹状形态过程中起重要作用[7]。
细胞的自噬过程是通过一系列Atg蛋白介导完成的，这些蛋白质在自噬发生的不同的阶段发挥各自的作用，LC3/Atg8是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ两种形式的LC3蛋白，在合成LC3蛋白后由Atg4蛋白酶切割其C端后形成LC3Ⅰ，其广泛分布于细胞浆内。随着自噬体的逐渐形成至完成后，LC3Ⅰ与PE通过偶联形成LC3Ⅱ定位于自噬体的内外膜上，LC3Ⅱ不同于其他自噬相关蛋白，能够稳定的存在于自噬体膜上，直到自噬体与溶酶体相互融合，因此LC3的表达水平可在某种程度上反映出自噬体的数量[8]。

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