胆碱是反刍动物日粮中重要的营养成分，但胆碱在瘤胃中极易被微生物降解生成三甲胺，而三甲胺对动物是有危害的。本试验通过瘤胃体外发酵方法研究瘤胃中胆碱的代谢规律以及胆碱对瘤胃甲烷生成、发酵参数以及相关微生物丰度的影响。研究结果表明，氯化胆碱能够促进瘤胃中第七目甲烷菌的增殖，提高总产气量、甲烷产量以及丙酸、丁酸、戊酸浓度，显著提高总挥发性脂肪酸浓度，但对瘤胃pH值以及乙酸、异丁酸、异戊酸浓度无显著影响，胆碱组中三甲胺浓度呈先升高后降低趋势。结论氯化胆碱改变了瘤胃发酵模式，胆碱在瘤胃中降解成三甲胺速度较快，三甲胺转化成甲烷的速度较慢。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1试验材料与设备 3
1.1.1试验材料 3
1.1.2试验设备3
1.2体外发酵3
1.3指标测定4
1.3.1不同时间甲烷、H2和三甲胺产量的测定4
1.3.2发酵液pH、挥发性脂肪酸脂肪酸（VFA）浓度的检测4
1.3.3发酵液中微生物DNA提取、定量PCR检测4
1.4 数据统计 4
2 结果与分析4
2.1瘤胃体外发酵过程中总产气量、H2以及甲烷含量的变化4
2.2瘤胃体外发酵过程中三甲胺含量的变化5
2.3发酵参数pH以及挥发性脂肪酸浓度的变化6
2.4发酵液中第七目甲烷菌、胆碱降解菌的定量分析7
3讨论7
3.1瘤胃体外发酵过程中总产气量、H2以及甲烷含量的变化7
3.2发酵参数pH以及挥发性脂肪酸浓度的变化8
3.3发酵液中第七目甲烷菌、胆碱降解菌的定量分析8
致谢8
参考文献9
胆碱对瘤胃甲烷生成、发酵参数以及相关微生物菌群的影响
引言
Methanomassiliicoccales
引言
胆碱是反刍动物日粮中常用的饲料添加剂，广泛存在于生物体和饲料内，常用于缓解反刍动物夏季热 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072* 
应激、防止脂肪肝、治疗奶牛产后瘫痪以及酮血症等代谢性疾病。另外，对于泌乳早期的奶牛而言，胆碱还能起到提高乳脂率的作用。胆碱含有3个活泼甲基，是体内的一种甲基供体，在甲基转换反应中起重要作用。反刍动物胆碱大部分来自天然饲料原料中植物细胞膜的磷脂酰胆碱、磷脂（卵磷脂）以及添加剂中的胆碱，同时机体还可利用饲料中的蛋氨酸、甜菜碱等经过甲基化等路径生成胆碱[1]。瘤胃是一个厌氧性微生物接种和繁殖的活体发酵罐，饲料的营养成分可被瘤胃微生物在一定程度上降解和转化[2]。饲料中的碳水化合物占大多数植物性饲料的75%左右，反刍动物采食的碳水化合物能在一定程度上被瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸，同时产生CO2和H2[3]。而H2和CO2是甲烷菌的重要能量来源。瘤胃甲烷的生成不仅是反刍动物摄入饲料能量的损失，还是重要的温室气体来源。研究发现，瘤胃甲烷主要是甲烷菌通过自身与其他瘤胃微生物（例如瘤胃细菌、瘤胃原虫以及厌氧真菌等）之间的种间氢传递来利用H2、CO2、甲酸和乙酸等生成甲烷[4]。在已经发表过的文章中发现，瘤胃甲烷可通过还原CO2H2、氧化甲酸、异化乙酸以及分化甲醇、甲胺这四种途径生成[5]。其中，甲烷的生成量大部分来自CO2H2还原合成甲烷途径[6]，该过程是一个氧化还原过程，CO2先与甲基呋喃反应，反应生成的结合物被还原后再与H4MPT进行反应，甲基最终由H4 MPT转移至CoM生成甲基辅酶M，然后形成甲烷[7,8]。由氧化甲酸生成甲烷途径中，甲酸先被分解为H2和CO2，而后H2、CO2经过氧化还原过程生成甲烷[7]；异化乙酸以及分化甲醇、甲胺途径反应过程相应较慢，只能产生极少的甲烷。然而,目前仍有大量甲烷菌的产甲烷机制及特性尚未被了解。因此，瘤胃甲烷减排一直是反刍动物营养研究领域的热点。
天然饲料原料中的胆碱、磷脂(卵磷脂)以及添加剂中的胆碱被反刍动物食入后，可被瘤胃细菌等微生物迅速降解，从而形成游离胆碱[8]。游离态的胆碱经过瘤胃微生物进一步代谢生成三甲胺(Ttimrthylamine, TMA)[9]。一部分三甲胺能够经过一系列生理生化过程形成甲烷，最后排出体外。研究发现，古细菌能够通过潜在的甲基化作用来利用H2生成甲烷，以消除有害物三甲胺[10]。而另一部分未被利用三甲胺能在瘤胃内聚集，当瘤胃中三甲胺积聚过多时，甲烷生成路径也会达到饱和状态，致使多余的三甲胺沉积在体内。而过量的三甲胺能通过门静脉转运至肝脏后在黄素氧化酶3(FMO3)的作用下生成氧化三甲胺(Trimethylamine oxide,TMAO)[11]，研究表明氧化三甲胺与血管炎症反应[12]、心脑血管疾病[13,14]以及肾功能损伤[15]等疾病都有密切的关系。随着宏基因组学、基因测序以及生物信息学等学科和技术的发展，学者们通过研究人类以及其他动物（包括昆虫，鱼类和哺乳动物）的肠道分离物发现，能够利用胆碱生成三甲胺的细菌均为兼性厌氧菌或专性厌氧菌，且普遍含有胆碱三甲胺裂解酶基因cutC[16]。尽管科学家们发现能够利用胆碱的细菌普遍含有cutC基因，但具体是哪些细菌尚不明确，并且能够影响肠道中胆碱和其他潜在三甲胺前体水平的因素，例如其他细菌的代谢活动以及其他环境因素，也尚不清楚。近年来，随着测序技术和体外培养技术的进步，越来越多的未知甲烷菌被发现，甲烷菌也由6个目扩展到7个目，而第七目甲烷菌"Methanomassiliicoccales"(Mmc)也已在反刍动物瘤胃[17,18]中被发现，且成为瘤胃中仅次于甲烷短杆菌目的第二大甲烷菌菌群[19,20]。体外培养、宏基因组学和基因组学研究发现第七目甲烷菌严格厌氧，属于甲基还原营养型，具有特殊的辅酶M甲基转移酶系统(Mt)，能以氢作为电子供体，还原C1甲基化合物生成甲烷[21]。研究发现许多第七目甲烷菌能利用H2还原三甲胺生成甲烷，如M. luminyensis[22]、Methanogenic archaeon ISO4H5[23]、Thermoplasmatales archaeon BRNA1[23]和Methanomassiliicoccus archaeon RumEn M2[24]等菌株。另有研究发现在日粮中使用富含胆碱、甜菜碱的糖蜜和小麦加工副产品等饲料原料时，或者直接添加胆碱和甜菜碱时，瘤胃中第七目甲烷菌的丰度会增加[25]。但厌氧胆碱代谢与第七目甲烷菌之间的关联尚不可知。
胆碱能被瘤胃细菌等微生物迅速降解，其一定会对瘤胃发酵情况以及微生物区系带来影响。瘤胃厌氧发酵是一个复杂的生理过程，产气量、pH、挥发性脂肪酸(VFA)浓度、微生物菌群种类和丰度等都是评定发酵情况的关键指标。产气量可以反映饲料在瘤胃内的降解情况，主要受可溶性非结构性碳水化合物与粗蛋白比例的影响，当两者之间的比例越大时，理论最大产气量越高[26,27]。瘤胃体外发酵产气量主要集中在1236 h，12h前为发酵延滞期，这期间由于微生物活性较低、数量较少，发酵速度较慢，因此产气量相对较低，1236 h期间由于微生物活性及数量高，可利用发酵底物多，产气量较高，36 h后底物中的可发酵营养成分已经被微生物发酵完成，后续可利用底物较少，因此产气量较低[27,28]。Swingle 等[29]的动物试验、许朝芳等[30]的体外发酵试验表明，在反刍动物日粮中添加胆碱对产气量并无显著影响。产气量可以反映饲料在瘤胃内的降解情况，而发酵液指标则可以反映饲料在瘤胃内的吸收代谢情况，比较真实的反映反刍动物对饲料的利用效果[27]。挥发性脂肪酸是饲料在瘤胃内发酵的主要产物之一，其种类和浓度是评价瘤胃发酵能力的重要指标。Atkins等[31]、Sharma等[32]以荷斯坦奶牛为试验动物，在其日粮中添加胆碱，研究发现添加胆碱能提升瘤胃中乙酸浓度[31,32]，这与本试验一致。Swingle 等[29]的体外发酵试验表明，胆碱能提升发酵液中总挥发性脂肪酸浓度，这与本试验结果一致。而Erdman等[33]对18头泌乳牛分别饲喂0g/kg、1.5g/kg和3g/kg的胆碱，发现胆碱对乙酸、丙酸、丁酸的浓度无显著影响，许朝芳等[30]的体外发酵试验和赵鹏等[34]、Soltan等[35]的动物试验也得出同样的研究结果。另外，Flachowsky 等[36]的体外发酵试验发现在日粮中添加胆碱会下调总挥发性脂肪酸浓度、乙酸和直链脂肪酸浓度，但对丙酸浓度无显著影响。pH是一项反映瘤胃内环境和发酵水平的综合指标，瘤胃微生物发酵底物产生的乳酸、挥发性脂肪酸等决定了瘤胃液pH值的大小[37]。瘤胃内正常pH略偏酸性,瘤胃微生物生长的最适pH值范围是6.07.0[38]。当pH<6.2时，微生物蛋白合成速率下降当pH<6.0时，纤维分解菌及原虫的活性受到抑制[27,39]。Erdman等[33]、赵鹏等[34]、Soltan等[35]的动物试验以及许朝芳等[30]的体外发酵试验发现，在反刍动物日粮中添加胆碱对瘤胃液pH并无显著影响，但另有学者发现添加胆碱能够提升[31]或降低[32]瘤胃的pH值。

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