1关键词 1ABSTRACT. 1KEY WORDS 1引言 11 材料与方法 21．1 实验材料与试剂 21．2 实验方法 21．2．1 猪卵泡的分离与分类 21．2．2 RNA的提取 31．2．3 反转录cDNA的合成 41．2．4 引物设计与合成 41．2．5 聚合酶链反应(PCR) 以及凝胶电泳检测 41．2．6 实时荧光定量PCR扩增（RT-qPCR） 41．2．7 荧光原位杂交（FISH） 51．2．8 统计分析 52 结果与分析 52．1 健康卵泡和闭锁卵泡的分类 52．2 circRNA的鉴定 62．3 circINHBB在猪卵巢卵泡中的分布 72．4 circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的差异性表达 83 讨论 8致谢 9参考文献 10环状circINHBB-614在猪卵泡闭锁过程中表达特征分析排卵数量是雌性哺乳动物高繁殖力的基础，而卵泡在发育的各个时期都可能发生生长停滞并退化的过程，即卵泡闭锁。卵泡闭锁是一个复杂的生理过程，受多种转录前、后的机制调控。为了探索环状RNA（circRNA）在卵泡闭锁过程中的调节作用，本实验拟以健康的母猪卵巢为实验对象，首先通过外部观察和相关激素、细胞的测定对卵泡进行分离和分类，再提取分离后卵泡中的RNA并通过反转录得到cDNA，设计引物进行PCR扩增验证准确性后，利用RT-qPCR探索circINHBB在卵泡闭锁过程中的表达模式和特征，最后利用FISH方法探明circINHBB在卵泡中的分布情况。本实验分析了circRNA在卵泡表达特征，为猪卵泡闭锁中circRNA的功能研究提供了可靠参考。
目录
引言
在母猪出生时，其体内原始卵泡池中约有五百万个原始卵泡，但是并不是所有的卵泡都能参与到排卵过程，大部分卵泡都会在发育过程中逐渐退化萎缩，最终被卵巢细胞所带消化吸收，这一生理活动就是卵泡闭锁，最终只有少数不到1%的卵泡能够顺利成熟并排卵[1]。
因为雌性动物卵泡发育的各阶段都存在着卵泡闭锁的现象，且大部分卵泡最终都会闭锁消失，又由于这一现象受多基因调控，所以对相关基因在卵泡闭锁的过程中发挥作用的研究具有十分重要的意义。关于卵泡闭锁的机制研究主要是集中在卵泡形态学和生物化学研究、颗粒细胞凋亡中信号通路的研究以及颗粒细胞凋亡中的转录机制研 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072^ 
究[2]。虽然关于卵泡闭锁的研究有很多，但是以相关基因的分子机制为切入点的研究却没有多少，仍然需要我们更加深入细致的探索与研究。
卵泡闭锁是动物机体内各类细胞如颗粒细胞、卵母细胞等以及卵泡液中的相关激素等组分特异性变化的后果[3]。一般来说，卵泡分为排卵卵泡和闭锁卵泡，在卵泡发育过程中不可能排出卵巢的卵泡就是闭锁卵泡，也就是说排卵卵泡最终一定会排出卵巢。关于卵泡闭锁的根本原因，大量的实验表明是由颗粒细胞凋亡导致的[4]。卵泡闭锁主要表现为卵泡由圆润光滑变为固缩变形，颜色由光亮变灰暗并有伴有出血点[5]，颗粒细胞离开颗粒细胞层悬浮于卵泡液中，卵丘细胞分解的同时卵母细胞破裂，透明带发生玻璃化并增厚等现象。
环状 RNA（circular RNA, circRNA）是一种特殊的非编码RNA，其特征是不含5’端和3’端的闭环结构，我们把这个环状结构称为共价修饰环状结构，其在真核生物内广泛存在且发挥着重要的生物学作用[6]。circRNA主要来源是RNA分子中的外显子或内含子，这一来源说明了其在生物体内存在的普遍性，同时circRNA也具有种类丰富、高度保守性、特异性、存在稳定等特点。
抑制素（Inhibin,INH）是一种特殊的性腺激素，其化学特性是糖蛋白，主要由雄性睾丸足细胞或雌性卵巢颗粒细胞分泌，它通过调节促卵泡素水平或者作为自分泌、旁分泌因子在局部发挥作用，在卵泡生长、发育、闭锁等过程中起重要作用。抑制素一般有两种，一是抑制素A（INHA），另一个是抑制素B（INHB）[7]。circINHBB是调节抑制素B合成的信使RNA前体剪切形成的，mRNA在内含子剪切过程中，外显子裸露出来的3、5端通过磷脂键相连形成了该circRNA[8]。circRNA在生物发育过程中发挥着不可或缺的作用，例如其与miRNA 的靶细胞结合对亲本基因的调控说明其有对基因的表达有着调控作用，同时circRNA在控制细胞的增殖、蛋白质的翻译过程也扮演着重要的角色，近年来关于这些方面的研究也越来越多，通过利用circRNA特殊的生物学特性，在畜牧生产中利用circRNA来提高畜禽的产肉产奶等经济性状也趋于实际[9]。
总之，circRNA 的研究虽然还不够成熟，还处于起步阶段，但其重要性不可忽视，尽管才刚刚兴起，很多问题仍待阐明，但随着研究水平的提高，对于circRNA的探讨也将会越来越清晰。研究分析环状RNA在猪卵泡闭锁过程中的表达特征，是更好掌握卵泡发育和闭锁全过程的重要一步，可以为提高家畜繁殖力的实践，如提高产仔数或产蛋量、提高畜禽的经济性状等提供理论基础。同时阐明相关机制也可以为在医学方面，例如治疗女性排卵有关的疾病等提供参考。
1 材料与方法
1．1 实验材料与试剂
本研究选取6月龄商品长白母猪的卵巢作为实验对象。规定取得的长白母猪双侧卵巢时间不得超过屠宰后5min不少于3min最佳，将取得的母猪卵浸在生理盐水中37℃的恒温下保存，生理盐水中可加入适量抗生素，猪卵巢不得裸露在空气中时间过长，否则会影响相应激素的浓度检测[10]。
主要试剂包括生理盐水、PBS、Trizol试剂（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、氯仿、0.1%DEPC水配制的75%乙醇、异丙醇溶液、TAKARA试剂盒、1.5%的凝胶（1.5g琼脂糖、100ml 1*TBE、67 μl显色剂）、乙醇（50%、80%、100%）、0.1％Triton X100透化试剂、4％多聚甲醛等。
主要仪器包括带目镜测微尺的显微镜、眼科剪、尖嘴镊子、收集管、高速离心机、高温灭菌锅、离心管、移液枪、Eppendorf分光光度计、水平电泳槽电泳仪、梯度PCR仪、电泳凝胶成像系统、超净工作台、RTqPCR仪、Zeiss LSM 700共聚焦显微镜、超低温冰箱等。
1．2 实验方法
1．2．1 猪卵泡的分离与分类
本实验通过：1）观察卵泡透明度、颜色，及外周血管的大体分布；2）测定卵泡液孕激素和雌激素浓度比值（P/E）；3）测定卵泡液中脱离颗粒细胞层的离散颗粒细胞的密度三种方式综合来对分离出的卵泡细胞进行分类，卵泡大致分为健康卵泡、早期闭锁卵泡、晚期闭锁卵泡三个类别[11]。具体操作步骤如下：
（1）用生理盐水将卵巢清洗2遍，在盛有少量PBS的平皿中用眼科剪将冲洗好的卵巢分割成若干个边长大约5mm的正方形块状，用尖嘴镊子分离出直径在35mm之间的单个有腔卵泡，尽可能清除卵泡周边多余的结缔组织，用PBS反复冲洗几次。
（2）用带目镜测微尺的显微镜观察卵泡，测量卵泡的最长端和最短端的长度，最后取两者平均平均值作为直径，选择直径大约35 mm的卵泡进行后续试验。
（3）根据操作说明和师姐提供的建议对分离出的卵泡进行外观形态判定，其中健康卵泡表现为微红色且透明清澈，早期闭锁卵泡表现为外观较浑浊且颜色较黄或较白，晚期闭锁卵泡则是外观浑浊且颜色灰褐色。
（4）将经过外观辨别后的卵泡小心存放于自制的带孔收集管中，目的是阻隔卵泡组织，而让卵泡液通过。将该收集管置于1.5mL离心管中离心10s后，可见卵泡液及卵泡腔内的颗粒细胞通过收集管的小孔沉入离心管，收集管中保留着其他卵泡组织。

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