目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 2
引言 2
1.材料与方法 3
1.1抗体及试剂 3
1.1.1抗体 3
1.1.2试剂 3
1.2实验方法 3
1.2.1实验动物的饲养及处理 3
1.2.2卵母细胞的采集及培养 3
1.2.3 BPA处理 4
1.2.4免疫荧光染色 4
1.2.5固定后染色封片 4
1.2.6活细胞染色 4
1.2.7数据统计 4
2结果与分析 5
2.1 BPA处理对小鼠卵母细胞发育能力的影响 5
2.2 BPA处理对小鼠卵母细胞线粒体分布的影响 5
2.3 BPA处理对小鼠卵母细胞内质网功能的影响 6
2.4 BPA处理对小鼠卵母细胞溶酶体功能的影响 7
3讨论 8
致谢 9
参考文献 10
环境内分泌干扰物双酚A对卵母细胞细胞器分布和功能的影响
摘要
双酚A（BPA）是一种生活中常见的环境内分泌干扰物（EEDs），在表面涂料等化工产品中都可以检测出其存在，极易在畜牧养殖过程中被家畜所接触，进而对家畜健康造成危害。研究证明，BPA具有的生殖毒性可以作用于哺乳动物的卵母细胞，对卵子成熟质量有很大影响。为了研究BPA对体外成熟的母细胞的细胞器是否存在毒性作用，本实验配制了不同浓度的BPA（100 μM、200 μM）培养液，对卵母细胞进行体外成熟处理，检测结果显示，BPA处理组卵母细胞发育能力显著降低。而后运用免疫荧光染色的方法，配合激光共聚焦显微镜，对BPA暴露引起的卵母细胞线粒体、内质网和溶酶体的分布和状态改变进行了检测。研究结果显示，200 μM BPA处理组的线粒体分布异常率显著升高，伴随内质网应激，GRP78荧光强度显著升高；此外，BPA处理还会造成溶酶体损伤，具体表现为溶酶体标志蛋白LAMP2的荧光强度显著升高。实验结果表明BPA暴露会扰乱线粒体正常分布、引发内质网应激并导致溶酶体损伤，进而干扰了 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: @351916072@ 
卵母细胞的减数分裂过程，最终导致卵子成熟质量降低。
引言
近年来，随着人类社会的不断发展，日益增长的环境污染与人类健康之间的矛盾也日益凸显，过量暴露在环境污染物下，可能引发极大的健康问题，其中就包括了近年来越发受到关注的生殖健康问题，而这一现状正受到国内外学者的广泛关注[1]。环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disruptors, EEDs）是一类常见的环境污染物，美国环境保护署（The U.S. environmental protection agency, EPA）将之定义为“干扰体内负责维持稳态、繁殖、发育和正常行为所需的自然激素的合成、分泌、转运、结合或衰减的一种物质”[2]，正因为EEDs可能导致哺乳动物的内分泌系统紊乱，干扰正常生殖功能，所以倍受各大研究机构关注。
双酚A(Bispherol A, BPA)是一种常见的环境内分泌干扰物，常被用作聚碳酸酯塑料和环氧树脂的合成单体[3][4]，在粘合剂、表面涂料等化工产品中都可以检测出其存在；此外，BPA具有一定的类雌激素作用，过量暴露可能会影响哺乳动物生殖内分泌系统健康，甚至会引发幼儿性早熟[5]。刘华良等[3]研究证实，饮用水中也可检测出少量BPA，因此在养殖过程中极易被家畜所接触。Zhang等[6]通过小鼠体内暴露实验表明，一定浓度的BPA处理会扰乱纺锤体排布、染色体联会以及动力微管组装，进而对第一极体的排出造成影响，破坏减数分裂进程，最终损害哺乳动物的生殖能力；而Li[7]等人的体外暴露实验也进一步证明了BPA存在一定的生殖毒性，会对卵子的发育成熟产生不良影响。然而，BPA阻滞卵母细胞发育的作用途径仍不明确，关于BPA对哺乳动物卵母细胞内细胞器功能的毒性作用的研究也较少。
保证卵母细胞的成熟质量是所有哺乳动物繁衍的基础。卵母细胞的发育成熟需要经历两次不连续的减数分裂，调控这一进程的分子机制十分复杂。对哺乳动物的卵子发生过程而言，第一次停滞将出现在第一次减数分裂(Metaphase Ⅰ, MⅠ)前期的双线期，此时的卵母细胞处于生发泡（Germinalvesicle, GV）期，这种状态直到动物生长至初情期才被打破；初情期时，在神经、激素和分子信号的刺激下，卵母细胞生发泡破裂（Germinal vesicle breaking down, GVBD），同时胞内染色质凝集为染色体，同源染色体在微管形成的纺锤体连结下发生联会，形成四分体，减数分裂继续进行。随后同源染色体分离，卵母细胞排出第一极体，此时标志这卵母细胞发育至核成熟；紧接着，卵母细胞进入第二次减数分裂(Metaphase Ⅱ, MⅡ)，并于第二次减数分裂中期发生第二次停滞，直到受到精子或其他理化因素刺激才继续发育至胞质成熟，排出第二极体[8]。卵母细胞的成熟质量对后续早期胚胎发育潜能有很大影响，而卵子发生过程的间断性导致了成熟卵母细胞质量极易受诸多因素影响，其中就包括了卵母细胞的细胞器功能[9]——线粒体、内质网、溶酶体等细胞器的胞质内分布在适宜区域，生理活动维持在正常水平，是决定卵母细胞发育水平的重要因素。Duan[10]等研究表明，过度暴露在有害物质下，不仅会导致卵母细胞发育受阻，而且会致使卵母细胞线粒体分布异常，最终影响卵母细胞的成熟质量。然而，BPA对于卵母细胞细胞器影响的相关研究至今仍较少。
本课题拟采用200 μM作为BPA工作浓度配制培养液，将BPA暴露的小鼠卵母细胞作为实验模型，探讨BPA暴露对小鼠卵母细胞成熟过程的影响，并从线粒体、内质网、溶酶体这三种细胞器分布及功能的角度着眼，对BPA导致的卵子损伤的部分作用途径做出阐释，为BPA对于卵母细胞细胞器功能的毒性作用提供依据。
1 材料与方法
1．1 抗体及试剂
1．1．1 抗体
兔源多克隆抗体LAMP2和GRP78购自Cell Signaling Technology (Devers, MA, SA)；山羊抗兔Alexa Fluor 594和488抗体(Carlsbad, CA, USA)、MitoTracker Red CMRos探针(Cat#M7512, Eugene, OR, USA)购自Invitrogen。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/605129.html